[發明專利]一種檢測土拉菌的基因液相芯片及其檢測方法

有效

• 申請號: 200910080262.2
• 申請日: 2009-03-17
• 公開（公告）號: CN101560562A
• 公開（公告）日: 2009-10-21
• 發明（設計）人: 王靜;文海燕;孫肖紅;楊宇;胡孔新;宋亞軍;劉衡川
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;G01N21/64;C12R1/01
• 代理公司: 北京中創陽光知識產權代理有限責任公司
• 代理人: 尹振啟

技術領域

本發明涉及一種檢測土拉菌(Francisella?tularensis，F.t)的基因液相芯片及 其制備方法。本發明還涉及利用所述的基因液相芯片進行檢測的方法。

背景技術

液相芯片檢測是近幾年發展起來的新興技術，具有快速、特異、敏 感的特點。懸浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的 微球，包覆不同比例的紅光及紅外光發色劑，而產生100種不同比例顏 色，作為100種獨特的色彩編號，每顆微球大小約5.5μm，可依不同研究 目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受體和配體識別分析等，并根據 不同研究目的而標定特定抗體、核酸探針及各種受體探針。

土拉菌(Francisella?tularensis，F.t)為需氧球桿狀小桿菌(0.2μm×0.2～ 0.7μm)，細胞單生，極其多形態，無芽孢，無動力；革蘭氏染色陰性， 染色時不易著色。本菌在普通培養基上不生長，在適當的固體培養基(如 含1％血紅蛋白的胱氨酸血瓊脂培養基)上培養2～4d可形成光滑、凸起的 灰白色菌落。血褪色并可以變成綠色。在石蕊牛奶中弱生長，可產弱酸。 最適生長溫度37℃，致死溫度56℃10分鐘。在低溫下能很好的存活。

菌培養是診斷土拉弗氏菌病的金標準，根據該菌37℃生長緩慢、28 ℃幾乎不生長的特性可與28℃較快生長的鼠疫桿菌、新兇手弗氏菌區別 開來，但因其容易引起實驗室感染，無法作為常規操作。而試管凝集法 的敏感性和特異性都很高。分子生物學方法主要有PCR、實時熒光PCR 等。

發明內容

本發明涉及一種改進的基因液相芯片及其制備方法，該基因液相芯 片可以用于病原體土拉菌的檢測。本發明還涉及利用所述的基因液相芯 片進行檢測的方法。

經過深入和大量的研究和實驗，本發明以土拉菌fopA基因特異性序 列為靶序列，建立了土拉菌液相芯片和檢測方法，為該菌的檢測提供一 條可行的途徑。

本發明所述的基因液相芯片包括：微球、捕獲探針、引物、PCR反 應體系、鏈親和素-藻紅蛋白，該基因液相芯片可檢測土拉菌。

本發明還涉及上述可檢測土拉菌的基因液相芯片，該芯片包括：熒 光編碼的微球、捕獲探針、引物、PCR反應體系、鏈親和素-藻紅蛋白， 其中

本發明的PCR反應體系包括：10×PCR緩沖液、dNTPs、Taq?DNA聚 合酶。

本發明的引物包括：

其中，下游引物是5’生物素標記的Ft-R。

具體例如是Ft-R：5’-生物素-GCTGTAGTCGCACCATTATCCT

本發明的捕獲探針，所述的捕獲探針具有特異性：

??探針 ??名稱 ??探針靶位 ??探針序列(5’-3’) ??Ft ??土拉菌fdX基因的989-1012 ??bp ??TGCTGGTTTAACATGGTTCTTTGG

上面所述探針在合成時在5’端進行氨基修飾，并且連接15-20個T 或連接C12作為間隔鏈，然后將探針與所選的編碼微球進行偶聯。

本發明的微球，一般選擇熒光編碼的微球，例如來源于Luminex或 其他代理公司的任何編號的微球，特異性探針與熒光編碼微球偶聯形成 檢測微球，由此構成檢測芯片。

本發明的鏈親和素-藻紅蛋白(Streptavidin-R-phycoerythrin，SA-PE) 為一種熒光蛋白，能被液相芯片檢測系統中的綠色激光激發發光，由此 可以進行定性或定量檢測。