[發明專利]抗A型肉毒毒素的人源性中和抗體及其應用

無效

• 申請號: 200910080021.8
• 申請日: 2009-03-17
• 公開（公告）號: CN101503472A
• 公開（公告）日: 2009-08-12
• 發明（設計）人: 于蕊;俞煒源;孫志偉;王雙;余云舟;林建波
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所
• 主分類號: C07K16/12
• 分類號: C07K16/12;A61K39/08;A61P31/04;A61P39/02
• 代理公司: 北京北新智誠知識產權代理有限公司
• 代理人: 程鳳儒

技術領域

本發明涉及抗A型肉毒毒素的中和抗體，具體地說是靶向抗A型肉毒毒素的特異性人源中和單克隆抗體及一種混合抗體。

背景技術

肉毒梭菌(Clostridium?botulinum)是一種厭氧的、革蘭氏陽性的孢子形成菌，肉毒毒素(botulinum?neurotoxin，BoNT)是由肉毒梭菌分泌的一種神經毒素，它可以作用于周圍運動神經末梢，神經肌肉接點即突觸處，抑制突觸前膜釋放神經介質——乙酰膽堿，從而引起肌肉松馳性麻痹。食品污染、嬰兒腸道感染及傷口感染是引起人類肉毒毒素中毒的主要原因[2]。肉毒毒素(BoNT)作為目前已知毒性最強的細菌蛋白質，共分為A-G七種血清型，其中A型肉毒毒素相比其它型可引起更嚴重的中毒癥狀和導致更高的死亡率。

肉毒毒素無論是作為生物武器，還是作為生物恐怖戰劑，或者是偶爾肉毒中毒及突發事件，其潛在的危害不可估計。國家在制定防御策略時必須考慮肉毒毒素的預防和治療問題。因此，進行肉毒毒素的防治研究無論是對國家生物安全、公共衛生安全及人民生命健康安全都具有重要現實意義和巨大社會價值。

隨著國際恐怖主義活動的日益猖獗，各國對于肉毒毒素中毒的防治也愈加重視。由于疫苗只能在中毒前發揮有效的預防作用，而肉毒毒素的中和抗體既可以在中毒前起到短期預防的效果，更可以在中毒后使用達到治療的目的，因此A型肉毒毒素中和抗體的研制不管對于普通民眾肉毒中毒的治療還是對于國家防御都具有重要意義。

目前治療肉毒毒素的方法是使用馬源的抗毒素血清，但由于馬血清的異源性、費用高、生產周期長等缺點，在一定程度上限制了它的應用。而研制具有中和作用的人源基因工程抗體成為目前人們研究的主要方向。許多實驗室獲得肉毒毒素中和抗體的方法是首先通過鼠雜交瘤技術獲得單克隆抗體，然后對這些鼠源抗體進行基因工程改造，使之能滿足人體使用的需要。但是這些抗體在人源化改造過程中往往存在親和力及活性下降等一系列問題。

隨著抗體庫技術的日漸成熟，應用噬菌體抗體庫展示技術、酵母展示技術及核糖體展示技術等直接獲得親和力高、特異性強、穩定性好、中和活性高的人源中和抗體，成為目前獲得肉毒毒素基因工程中和抗體的主要方法，特別是利用噬菌體抗體庫技術制備人源性抗體是一種比較簡單、快速且經濟的方法。

隨著噬菌體抗體庫技術的快速發展，從大容量人噬菌體抗體庫中篩選制備中和性抗體具有很多優勢：首先它的快速、高通量篩選更利于在較短時間內篩選到大量的候選克隆；其次由于抗體庫的容量較大，理論上更容易篩選到高親合力的特異性抗體；再次從人噬菌體抗體庫中篩選到的抗體均為人源抗體，不需要經過改造便可直接應用于人體。

目前肉毒毒素基因工程中和抗體的研發均處于實驗室研究或臨床前的中試生產階段，還沒有一種中和性抗體被批準上市。肉毒毒素中和抗體的研制之所以比較困難，其中重要的一點就是目前所獲得的中和抗體，不論親和力多高，單一抗體均不能很好地完全中和毒素，而兩個或三個抗體聯合使用則會大大提高中和活性，這可能與毒素本身具有多個受體結合區有關。針對肉毒毒素與受體細胞結合的雙受體多表位的特點，必須研制多株具有不同表位的抗體進行聯合使用，才能達到完全封閉結合表位的作用，從而起到較好的中和保護效果。

發明內容

為了解決現有技術中存在的問題和空白，本發明的目的在于提出兩種無需經人源性改造即可直接應用于人體的高親和性、高中和性抗A型肉毒毒素人源性中和抗體。

本發明的另一目的在于，提出上述抗A型肉毒毒素人源性中和抗體的新應用。

本發明的發明思路及技術方案為以A型肉毒毒素保護性抗原He為篩選抗原，通過對庫容量達到1.35×1010的大容量全合成人噬菌體單鏈抗體庫進行篩選，在篩選方法上進行了改進，通過固相篩選、夾心法篩選及固相競爭篩選三種不同篩選方式共獲得兩個具有體內外中和活性且針對不同抗原表位的A型肉毒毒素特異性抗體C10、1B6，從而為A型肉毒毒素的中毒治療提供有效的治療手段。

為實現本發明的發明目的，本發明的具體技術方案為：

一種抗A型肉毒毒素的人源性中和抗體，該抗體是針對A型肉毒毒素的抗體，其輕鏈CDR3區含有如序列表SEQ?ID?No.1所示序列的90-99位氨基酸殘基序列，其重鏈CDR3區含有如序列表SEQ?ID?No.2所示序列的99-106位氨基酸殘基序列。

上述的一種抗A型肉毒毒素的人源性中和抗體，其中，該抗體輕鏈可變區基因序列如SEQ?ID?No.1所示，重鏈可變區基因序列如SEQ?ID?No.2所示。