[發明專利]一種乙肝病毒雙表達質粒及構建方法和應用

無效

• 申請號: 200910079304.0
• 申請日: 2009-03-05
• 公開（公告）號: CN101824430A
• 公開（公告）日: 2010-09-08
• 發明（設計）人: 貌盼勇;沈宏輝;辛紹杰;王福生;胡燕;白冰珂;侯俊;張敏;赫兢;欒翔玲;王志杰
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三〇二醫院
• 主分類號: C12N15/79
• 分類號: C12N15/79;A61K48/00;A61K39/29;A61P31/20;C12R1/93
• 代理公司: 北京北新智誠知識產權代理有限公司 11100
• 代理人: 耿小強

1.一種乙肝病毒雙表達質粒，其特征在于，其包括真核細胞表達載體VR1012上插入核苷酸序列的乙肝病毒前C-C基因和自身復制調控元件增強子II以及含調控序列的乙肝病毒前S-S基因和自身復制調控元件增強子I。

2.一種乙肝病毒雙表達質粒的構建方法，其步驟如下：首先以血清中的HBV?DNA為模板，用套式PCR分別擴增出乙肝病毒增強子II/前C-C基因或增強子I/前S-S基因，然后通過基因克隆連入真核表達載體VR1012，克隆篩選得到單表達質粒VEC和VES；采用單引物二次PCR法突變VES，在調控表達單元下游插入酶切位點，PCR擴增VEC中完整的調控和表達單元并克隆到突變后的VES中，克隆篩選得到利用各自的啟動子分別表達前C-C和前S-S的雙表達質粒。

3.根據權利要求2所述的乙肝病毒雙表達質粒的構建方法，其特征在于：所述的單引物二次PCR法為點突變，第一輪PCR，加入正向單引物擴增，得到少量變異鏈；第二輪PCR，加入反向單引物，反向單引物序列與正向變異鏈互補。

4.根據權利要求2或3所述的乙肝病毒雙表達質粒的構建方法，其特征在于：所述的單引物二次PCR法突變VES，首先合成1對引入插入突變的引物，插入NheI、Pac?I、Fse?I和Age?I酶切位點，VR-正向和VR-反向；進行第一輪PCR：以VES質粒為模板，加入正向引物VR-正向，PCR擴增；再進行第二輪PCR：以第一輪PCR反應產物為模板，加入反向引物VR-反向，PCR擴增；然后對PCR產物進行選擇性酶切，轉化細菌后克隆篩選得到突變VES基因。

5.根據權利要求2所述的乙肝病毒雙表達質粒的構建方法，其特征在于：所述的PCR擴增VEC，以含Nhe?I酶切位點的VR2012-PF為正向引物、含Age?I酶切位點的VR2012-PR為反向引物。

6.一種乙肝病毒雙表達質粒的構建方法，其步驟如下：首先以血清中的HBV?DNA為模板，用套式PCR分別擴增出乙肝病毒增強子II/前C-C基因和增強子I/前S-S基因，然后通過基因克隆連入真核表達載體VR1012，克隆篩選得到單表達質粒VEC和VES；采用單引物二次PCR法突變VEC，在調控表達單元下游插入酶切位點，PCR擴增VES中完整的調控和表達單元并克隆到突變后的VEC中，克隆篩選得到利用各自的啟動子分別表達前C-C和前S-S的雙表達質粒。

7.根據權利要求1-6中任一項所述的乙肝病毒雙表達質粒在預防和治療乙型肝炎基因疫苗中的應用。