[發明專利]檢測鄰烯丙基苯酚的試劑盒及其專用抗體

無效

• 申請號: 200910079260.1
• 申請日: 2009-03-05
• 公開（公告）號: CN101498728A
• 公開（公告）日: 2009-08-05
• 發明（設計）人: 李健強;夏源源;王保民;曹永松;劉西莉;羅來鑫;劉鵬飛
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N30/02;C07K16/44;C07K14/765;C07K14/77;C12N5/20
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司
• 代理人: 關 暢

技術領域

本發明涉及檢測鄰烯丙基苯酚的試劑盒及其專用抗體。

背景技術

鄰丙烯基苯酚(2-propenylphenol，商品名稱銀果)是山東省農業仿生應用工程 研究中心開發研制的新型農用殺菌劑，已獲得了國家發明專利(ZI?97?121?037.3) 和農藥臨時登記(防治番茄灰霉病)，現已批量生產。它是以銀杏中的殺菌、抑菌活 性化合物的化學結構為模板.經結構簡化后通過人工模擬化學合成得到，分子量為 134，分子式為C₉H₁₀O。田間藥效試驗證明，鄰丙烯基苯酚可有效防治草莓白粉病、 番茄灰霉病、蘋果腐爛病、玉米大斑病等病害。但是殺菌劑用量過多，會在農產品 中殘留，影響人的身體健康。

目前，鄰烯丙基苯酚的分析方法有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法等。 這些方法存在如下主要局限：樣品前處理時間長，實驗設備昂貴，試劑等成本高； 對于大量樣品的測定有一定的困難，尤其是在快速檢測果實中的農藥殘留量時，這 些方法都顯得無能為力。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種檢測鄰烯丙基苯酚的試劑盒。

本發明所提供的檢測鄰烯丙基苯酚的試劑盒，包括抗鄰烯丙基苯酚的單克隆抗 體或抗鄰烯丙基苯酚的多克隆抗體；所述單克隆抗體或多克隆抗體可以是以具有如 下結構的抗原為免疫原得到的：

其中，所述抗鄰烯丙基苯酚的單克隆抗體具體可以是由保藏號為CGMCC?No. 2905的小鼠雜交瘤細胞系mAb225#分泌產生的。

由保藏號為CGMCC?No.2905的小鼠雜交瘤細胞系mAb225#分泌產生的抗鄰烯丙 基苯酚的單克隆抗體也屬于本發明的保護范圍。

本發明所提供的抗鄰烯丙基苯酚抗體，是用鄰烯丙基苯酚與對氨基苯甲酸衍生 后的抗原免疫動物，然后從被免疫動物的血清中分離得到的。

鄰烯丙基苯酚是小分子物質，不具備免疫原性，不能直接刺激動物產生抗體， 要想制備鄰烯丙基苯酚的抗體，就必須把鄰烯丙基苯酚與相應大分子載體蛋白偶聯 構建人工抗原，但因為其化學結構過于簡單在與蛋白連接前必須進行一步衍生才能 繼續合成全抗原，并用此人工抗原免疫動物產生特異性抗體。

本發明的另一個目的是提供一種制備鄰烯丙基苯酚抗原的方法。

本發明所提供的制備鄰烯丙基苯酚抗原的方法，包括如下步驟：

1)將對氨基苯甲酸重氮化，得到重氮化對氨基苯甲酸；

2)將所述重氮化對氨基苯甲酸與鄰烯丙基苯酚耦合，得到重氮化鄰烯丙基苯 酚；

3)將所述重氮化鄰烯丙基苯酚與載體蛋白偶聯，得到鄰烯丙基苯酚抗原。

所述重氮化包括如下步驟：將對氨基苯甲酸溶解于0.5-1.5M?NaNO₂溶液中， 對氨基苯甲酸在NaNO₂溶液中的終濃度為67.6mM～107.9mM，再向其中加入酸， 反應，得到含有重氮化對氨基苯甲酸的溶液I；

所述耦合包括如下步驟：將鄰烯丙基苯酚溶解于甲醇中，得到溶液II，鄰烯丙 基苯酚在溶液II中的終濃度為74.6mM～111.9mM；將溶液I滴入溶液II中，反應 3-5h，將pH值調至2-3，收集沉淀，即得重氮化鄰烯丙基苯酚。

所述偶聯包括如下步驟：將所述重氮化鄰烯丙基苯酚溶解于N，N-二甲基甲酰 胺、二氧六環或二甲基亞砜中，再在避光條件下向其中加入N-羥基琥珀酰亞胺，再 加入二環己基碳二亞胺，反應2～5h，取上清；將載體蛋白加入所述上清中，反應 10-14h，得到鄰烯丙基苯酚抗原。

其中所述N-羥基琥珀酰亞胺在反應體系中的終濃度可為47.8mM～191.7mM； 所述二環己基碳二亞胺在反應體系中的終濃度可為124.1mM～489.5mM；所述載體 蛋白在反應體系中的終濃度可為0.10mM～0.41mM。

為了使效果更好，所述載體蛋白可以先在0～10℃條件下溶解于pH9～10的碳 酸鹽緩沖液中，再加入所述上清中。

所述載體蛋白可為牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、蘭素蛋白 (KLH)、卵清白蛋白(OVA)等。