[發明專利]一種可定量檢測鼠疫耶爾森菌的蛋白懸浮芯片及其制備方法

無效

• 申請號: 200910078820.1
• 申請日: 2009-03-04
• 公開（公告）號: CN101493469A
• 公開（公告）日: 2009-07-29
• 發明（設計）人: 王靜;孫肖紅;周蕾;楊宇;胡孔新;張曉龍
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/546;G01N33/533
• 代理公司: 北京中創陽光知識產權代理有限責任公司
• 代理人: 尹振啟

技術領域

本發明涉及一種可定量檢測細菌的蛋白質懸浮芯片及其制備方法，尤其是適合定量檢測和分析鼠疫耶爾森菌(Yersinia?pestis)的蛋白質懸浮芯片。

背景技術

鼠疫耶爾森菌(Yersinia?pestis)為呈革蘭氏染色陰性、不運動、不形成芽孢的球桿菌，吉母薩、瑞特氏或威森染色呈雙極濃染，能在4-40℃范圍內生長，最適生長溫度為28-30℃，最適生長pH值為7.2-7.6，pH的耐受上下極限分別為pH5.0和pH9.6。鼠疫菌由假結核菌進化而來，正處在進化的活躍時期，其主要宿主為嚙齒動物，主要通過蚤的叮咬在動物間傳播。偶爾可經跳蚤叮咬或接觸帶有鼠疫菌的動物、動物皮毛等引發人類疾病。患者在被染有鼠疫菌的跳蚤叮咬216天后，出現腺鼠疫的癥狀如發熱、寒顫、頭痛、虛弱、嘔吐，淋巴結腫大。原發性敗血型鼠疫的臨床癥狀與其他G-引起的敗血癥類似，引起病人發燒、寒顫、頭痛，有少數患者會由敗血型鼠疫發展為肺鼠疫。通過呼吸道途徑感染的患者發生原發性肺鼠疫，潛伏期為113天，起初象流感癥狀，迅速發展為肺炎并伴有咳嗽和血痰。腺鼠疫不經治療的死亡率約為60％，用抗生素治療后降低到5％以下；敗血型鼠疫和肺鼠疫不經治療死亡率高達100％。

鼠疫在歷史上曾經引起三次世界范圍的大流行，使人類遭受了深重的災難。隨著醫療衛生水平的提高，鼠疫已經得到較好的控制。但是，20世紀90年代以來，世界鼠疫開始活躍，發病人數和疫源地面積都有擴大的趨勢，2000年世界衛生組織(WHO)將鼠疫列為重新抬頭的傳染病。同時，鼠疫菌傳染性強、發病迅速，是生物戰劑和生物恐怖的重要病原之一。

出于公共衛生和國家安全的目的，研究和開發快速、定性、定量檢測傳染病病原體是所屬技術領域中長期致力追求的目標。尤其對于鼠疫菌來說，作為一種烈性傳染病的病原體，能否實現定量檢測至關重要。目前用于鼠疫菌的實驗室常規檢測方法有細菌學檢測方法、血清學檢測方法及檢測核酸的分子生物學方法(Perry，R.D.&Fetherston，J.D.Yersinia?pestis--etiologic?agent?of?plague.Clin?Microbiol?Rev1997，10(1)，35-66.)。但是，細菌學檢測方法、血清學檢測方法(例如間接血凝方法)及核酸檢測法等現有檢測技術存在許多缺陷。對于細菌學檢測法，細菌培養耗時較長，不適合對鼠疫菌的快速檢測。莢膜抗原(F1抗原)是目前公認的鼠疫菌種特異性抗原之一，檢測鼠疫菌F1抗原及其抗體是鼠疫診斷的重要依據(Drobkov?VI，Abdullin?JG，DarmovIV.Use?of?the?enzyme?immunoassay?in?the?laboratory?diagnosis?ofplague[J].Zhurnal?Mikrobiol.Epidemiol.Immunobiol.1992，16(10)：40-42.；Williams?JE，Arntzen?L，Tyndal?GL，Isaacson?M.Applicationof?enzyme?immunoassay?for?the?confirmation?of?clinically?suspectplague?in?Namibia，1982.Bull.W.H.O.1986，62：745-752.)。檢測鼠疫菌特異性抗體(F1抗體)的間接血凝方法(IHA)，靈敏度低，特異性差(Williams，J.E.，Arntzen，L.，Robinson，D.M.&et?al.Comparison?of?passive?haemagglutination?and?enzyme-linkedimmunosorbent?assay?for?serodiagnosis?of?plague.Bull?WHO?1982，60，777-781.)。對于核酸檢測法，盡管采用了PCR技術對鼠疫菌進行檢測和分析(Hinnebusch，J.&Schwan，T.G.New?method?for?plaguesurveillance?using?polymerase?chain?reaction?to?detect?Yersiniapestis?in?fleas.J?Clin?Microbiol?1993，31(6)，1511-1514.；Higgins，J.A.，Ezzell，J.，Hinnebusch，B.J.，Shipley，M.，Henchal，E.A.&Ibrahim，M.S.5′nuclease?PCR?assay?to?detect?Yersinia?pestis.JClin?Microbiol?1998，36(8)，2284-2288.；Neubauer，H.，Meyer，H.，Prior，J.，Aleksic，S.，Hensel，A.&Splettstosser，W.Acombinat?ion?of?different?polymera?se?chain?reaction(PCR)assaysfor?the?presumptive?identification?of?Yersinia?pestis.J?Vet?MedB?Infect?Dis?Vet?Public?Health?2000，47(8)，573-580.)，尤其是實時熒光定量PCR技術(Herber?t，T.，Emil，C.R.，Sascha，A.D.&etal.Rapid?detection?of?Yersinia?pestis?with?multiplex?real-timePCR?assays?using?fluorescent?hybridisation?probes.FEMS?ImmunolMed?Microbiol?2003，38，117-126)，特異性高，不容易被污染，但是現有PCR技術的方法繁瑣，特別是此類方法包括DNA/RNA的提取和復雜的操作步驟，而且不能用于非核酸物質如蛋白質的檢測，因此核酸檢測法具有局限性且不方便。