[發明專利]一種檢測檳榔黃化病植原體病原的方法及其專用試劑盒

有效

• 申請號: 200910077044.3
• 申請日: 2009-01-16
• 公開（公告）號: CN101475995A
• 公開（公告）日: 2009-07-08
• 發明（設計）人: 車海彥;羅大全
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司
• 代理人: 關 暢

技術領域

本發明涉及一種檢測檳榔黃化病植原體病原的方法及其專用試劑盒，適合于檢疫、農業生產、植物保護等部門使用。

背景技術

檳榔(Areca?cathecu?L.)是我國重要的南藥資源之一，據海南省農業廳統計，截至2006年底，海南省檳榔種植面積達5.31萬公頃，收獲面積2.33萬公頃，總產量7.48萬噸，產值18億元以上。

檳榔黃化病是一種毀滅性病害，最早在印度的Kerala中部發生，到20世紀60年代，印度Kerala邦的Quilon地區檳榔黃化病已經普遍發生。1981年，檳榔黃化病首次在我國海南省藥材場(屯昌縣)發現；上世紀90年代初，海南島內的部分檳榔種植區相繼開始發現黃化病的為害；據2006年調查，檳榔黃化病除在海南屯昌縣發生外，已蔓延到瓊海、萬寧、陵水、三亞、保亭等縣市的成片檳榔園中，嚴重威脅著海南省檳榔產業的發展。

檳榔黃化病在田間的癥狀表現為：發病初期，植株下部倒數第2～4張羽狀葉片外緣1/4開始出現黃化，抽生的花穗較正常植株短小，無法正常展開，結果量大大減少，常常提前脫落，減產70～80％，少量存留的果實品質嚴重降低，無法食用。節間縮短，感病植株葉片黃化癥狀逐年加重，干旱季節黃化癥狀更為突出，整株葉片無法正常舒展生長，解剖可見病葉葉鞘基部剛形成的小花苞水漬狀敗壞，嚴重時呈暗黑色，花苞基部有淺褐色夾心；感病后期病株根莖部壞死腐爛，大部分感病植株開始表現黃化癥狀后5～7年枯頂死亡。檳榔生理性黃葉是由于檳榔園管理不善，缺肥或干旱引起，檳榔葉片發黃現象呈現區域性，成片發生，一般是下部葉片均勻黃化，嚴重的干枯死亡，而黃化病則有明顯的發病中心，即在檳榔園開始發病時僅少量植株有黃化的表現。通過大田流行規律調查、電子顯微鏡觀察、四環素族抗菌素注射診斷等研究表明，植原體(Phytoplasma)是導致海南檳榔發生黃化病的病原(羅大全，陳慕容，葉沙冰，蔡希灼.海南檳榔黃化病的病原鑒定研究.熱帶作物學報，2001，22(2)：43-46.)。

植原體(phytoplasma)，原稱類菌原體(mycoplasma-like?organism，MLO)，為單細胞原核生物，無細胞壁，由生物膜包圍，隸屬于細菌界(Bacteria)，硬壁菌門(Firmicutes)，柔膜菌綱(Mollicutes)(又稱軟球菌綱)，非固醇菌原體目(Acholeplasmatales)，非固醇菌原體科(Acholeplasmataceae)。定殖于植物韌皮部篩管以及刺吸式介體昆蟲的腸道、淋巴、唾腺等組織內，植原體通常在植物體中含量較低，難以人工培養，且分布不均勻。研究者們根據植原體的16SrDNA序列對植原體進行分類，將已報道的植原體分為14個組38個亞組，其中翠菊黃化組(AY組，16Sr?I)是植原體中包含植原體數量最多的組，被分為6個亞組，(Lee?I?M，Davis?R?E，Gundersen-Rindal?D?E.Phytoplasma：Phtopathogenic?Mollicutes.Annual?Review?Microbiology，2000，54：221-255)。

植原體在世界范圍內引起多種經濟上重要的植物病害，如：椰子致死黃化病、棗瘋病等。植原體病害主要通過無性繁殖材料、種苗或昆蟲介體傳播，很少或不能種子傳毒，目前尚無很好的防治辦法，唯有通過設立和建設無病區、加強植物檢疫嚴防病害蔓延和擴散，因此病害的早期診斷和疫情監測對于病害的檢驗檢疫和防范控制具有重要意義。植原體病害的檢測目前主要有電子顯微鏡法，組織化學技術，血清學方法，核酸雜交技術，PCR技術等，特別是根據16SrDNA設計廣譜引物和特異性引物對植原體進行PCR檢測，已被廣泛應用，在植原體的研究中有了歷史性的進步。但上述這些方法整個過程繁雜，操作步驟多，需要消耗大量的時間，不適合大批量的樣品檢測，如瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色，紫外光觀察結果或通過聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染檢測，如果要鑒定到種或組，還要進行限制性內切酶多態性分析(RFLP)，或者進行核酸序列測定和同源性比較，不僅需要多種儀器，而且費時費力，所使用的染色劑溴化乙錠對人體又有害，這些繁雜的實驗過程又給污染和假陽性提供了機會，嚴重影響對結果的正確判斷。