[發明專利]與A-beta寡聚體特異性結合的基因工程單克隆抗體

無效

• 申請號: 200910076991.0
• 申請日: 2009-01-16
• 公開（公告）號: CN101463083A
• 公開（公告）日: 2009-06-24
• 發明（設計）人: 劉瑞田;王小平
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;C12N1/21;G01N33/577;A61K39/395;A61P25/28;C12R1/19
• 代理公司: 北京思海天達知識產權代理有限公司
• 代理人: 張 慧

技術領域

本發明屬基因工程抗體技術領域，具體涉及與A-beta寡聚體特異性結合的 基因工程單克隆抗體，本發明還涉及該單克隆抗體的制備方法以及含有該單克 隆抗體的藥物組合物。

背景技術

研究表明阿茲海默病(Alzheimer’s?Disease，簡稱AD)，俗稱老年性癡呆 是由無毒性的β-淀粉樣蛋白單體分子(β-Amyloid，A-beta?40/42以下簡稱A-beta， 也可寫成Aβ)聚集形成具毒性作用的寡聚體引起的老年人主要以記憶力下降和 腦部形成老年斑為特征的神經退行性疾病(Selkoe等，Science?1997，275， 630-631；Koo等，PNAS?1996，9989-9990)。醫學統計表明，我國和歐美國家 中60歲以上老年人有5～6％患有阿茲海默病。該病已被列為導致死亡的第四 大疾病，僅次于心臟病、癌癥和中風。我國現有60歲以上人口約一億，按照 60歲以上人口中老年性癡呆患病率為5％估算，全國可能有老年性癡呆患者約 500萬。該病已給家庭和社會帶來巨大的負擔。

近幾年的實驗研究越來越多地證明，由A-beta單體凝聚形成絲狀物的中間 產物-A-beta寡聚體是引起AD的主要致病因子，而不是先前認定的絲狀聚集 體(Haass，C.等，2007，Nature?reviews?8，101-112；Lesne，S，2006，Nature?440， 352-357；Shankar，G.M，2008，Nature?medicine?14，837-842)。然而，目前國 際上現有的檢測及治療AD用抗體，大多是針對A-beta一級序列，即A-beta單 體的抗體，這類抗體能夠和A-beta單體、寡聚體及絲狀體同時結合，在實驗研 究、病理檢測及臨床診斷中不能夠特異地檢測出真正起致病作用的寡聚體水平 的高低。同時，這類抗體在對AD的治療中易引起大腦出血和腦膜腦炎等嚴重 的副作用。

Glabe實驗室在2003年的Science雜志上報道了可以與寡聚體特異結合的 抗體A11(Kayed等，2003，Science?300，486-489)。但這種抗體是一種多克 隆抗體，在每一生產批次中含有的針對每一種抗原決定簇的各抗體成分的量無 法控制，影響檢測結果的可比性。并且該抗體不僅與A-beta寡聚體結合，它還 與alpha-synuclein、Prion蛋白、胰島素、溶菌酶等多種寡聚體結合，無一級序 列的特異性。

單鏈抗體(single?chain?FV，ScFv)是一個重要的基因工程抗體，是在DNA 水平上利用基因工程方法使抗體重鏈可變區(VH)基因和輕鏈可變區(VL)基因 通過一段約5～25個氨基酸(linker)的連接肽連接形成的重組蛋白。單鏈抗體的 C末端可以引入半胱氨酸尾、酪蛋白激酶底物尾、E尾等結構，有助于標記和 偶聯其它分子，也可以引入鈣調蛋白尾、c-myc尾、葡萄球菌A蛋白尾、脂類 標簽、組氨酸尾等，使表達產物易于檢測和純化。

單鏈抗體具有自身的一系列特點：

(1)只含有抗體的V區，能保持較完整的抗原結合位點；

(2)缺乏Fc段，不與非靶細胞結合，有利于作為藥物導向載體用于臨床；

(3)免疫原性低，用于人體不易產生抗異種蛋白反應；

(4)分子量小，容易穿透血管壁、組織及實體瘤；

(5)體內血循環半衰期短，易從血循環中排除；

(6)在其基因的3’端連接適當的目的分子，如：酶、毒素、藥物等可構 建雙功能抗體；

(7)只與抗原結合，不激活補體介導細胞免疫；

(8)易于基因操作和基因工程大量生產。

近年，單鏈抗體已逐漸成為基因工程抗體研究領域中的熱點之一，在疾病 的臨床診斷和治療方面顯示出了巨大的潛力。

目前，國際上僅見有一個關于特異結合A-beta寡聚體的單鏈抗體scFv的 報道(Zameer?A等，2008，J?Mol?Biol.384：917-928)，該scFv與A-beta寡聚體 的親和力較低。另有一類抗體NU1、NU2和NU4雖與A-beta單體結合不明顯， 但是它們可以同時與A-beta寡聚體和絲狀體結合，從而影響對樣品中A-beta寡 聚體的檢測(參見Lambert等，2007，Journal?ofneurochemistry?100，23-35)。 到目前為止，國內尚未見特異結合A-beta寡聚體的單克隆抗體或單鏈抗體的報 道。