[發明專利]一種產丁醇梭菌的細胞固定化方法

無效

• 申請號: 200910076955.4
• 申請日: 2009-01-14
• 公開（公告）號: CN101475932A
• 公開（公告）日: 2009-07-08
• 發明（設計）人: 張躍冬;馬玉久;楊芳曉;張春輝
• 申請（專利權）人: 青島生物能源與過程研究所
• 主分類號: C12N11/14
• 分類號: C12N11/14
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司
• 代理人: 周長興

技術領域

本發明涉及一種細胞固定化方法，固定化細胞為產丁醇梭菌，固定化載體為玉米秸稈，對玉米秸稈預處理后，直接吸附指數生長期的梭菌培養基，得到固定化細胞，可用來發酵生產丙酮丁醇。

背景技術

丙酮和丁醇作為重要的溶劑，具有廣泛的用途。從20世紀50年代以來丙酮和丁醇發酵工業受到石油工業的嚴重沖擊，丙酮和丁醇發酵工業走向衰退。隨著石油資源逐步走向枯竭，世界原油價格的飛漲，古老的丙酮和丁醇發酵技術，作為一項有效的、利用生物質資源生產燃料的生物轉化技術，又重新被人們所認識，特別是丁醇作為一種極具潛力的新型燃料已經引起國內外的高度重視，2005年美國進行了完全以丁醇為燃料的汽車實驗，前景廣闊，纖維素丁醇作為第二代生物燃料的代表，使用木質纖維素糖化原料作為碳源，不僅原料來源豐富，在確保國家糧食安全，減少大氣碳排放等方面，均具有重大的戰略意義。

發酵生產丙酮和丁醇，主要通過丙酮丁醇梭菌或拜氏梭菌等產溶劑微生物，通過ABE(acetone-butanol-ethanol)發酵過程得來。傳統的ABE發酵，產溶劑梭菌先經歷一個階段的產酸期，首先生成乙酸、丙酸、丁酸，然后改變代謝，吸收有機酸，并生成溶劑。因為溶劑對微生物的抑制作用，發酵液中的溶劑濃度很低，傳統的ABE批次發酵工藝往往需要大型的發酵罐和較長的發酵周期，溶劑的產率一般在0.1-0.3gl-1h-1之間。近20年來，許多工程手段被用來提高ABE的產率，其中提高細胞濃度和利用率是目前提高ABE產率的一個重要思路。細胞回收和細胞固定化是最為廣泛研究的細胞富集策略。細胞回收利用膜過濾、離心等方式將微生物細胞與發酵液分離后再返回反應器進行利用。但在處理如纖維素糖化液等富含雜質的發酵液時，容易遇到膜堵塞以及固體雜質積累等問題，同時濾膜的造價以及更換頻率問題也使得細胞回收策略難以在工業大規模應用時采用。

細胞固定化作為另一種細胞富集策略，將細胞固定于載體之上，并使細胞在載體上生長分裂，以得到高濃度的細胞。細胞固定化主要有三種方式：包埋，共價結合，吸附。包埋和吸附需要用到額外的化學試劑，不僅提高了生產成本，而且對細胞的生長和分裂產生了影響。細胞吸附利用微生物自然的吸附屬性，固定于載體之上，并且在載體上生長分裂，吸附載體的開發研究作為細胞固定化的熱門見于諸多報道。有人使用多孔陶瓷，塑料等載體作為產溶劑微生物的固定化載體，雖然細胞富集效果較好，但造價太高；后來也有人用木屑，黏土磚，骨渣等價格便宜的載體，但其生物過量生長堵塞后固定床廢棄載體的處理同樣成為工業化放大的難題。

發明內容

本發明的目的在于提供一種產丁醇梭菌的細胞固定化方法，此方法可以提高丙酮丁醇的生產速率，延長反應器生產周期，降低生產成本，并且固定化材料可被降解，便于處理，環境友好。

為實現上述目的，本發明提供的方法，采用產丁醇梭菌(拜氏梭菌或者丙酮丁醇梭菌)，在厭氧條件下游離培養至指數生長期進行固定化吸附。吸附固定化細胞載體采用玉米秸稈，將玉米秸稈去葉削皮后，使用小刀或粉碎機切成體積0.05-1cm²小塊，使用0.2-2％(v/v體積比)的鹽酸或硫酸100℃水浴浸煮10-60分鐘，或者116-121℃蒸煮5-30分鐘后，使用2-5倍體積清水洗滌2-5次，80-120℃烘干到恒重后，滅菌用于細胞吸附。或者洗滌后滅菌直接用于細胞吸附。

吸附時將上述方法處理過的玉米秸稈浸入指數生長期的產丁醇梭菌細胞培養液中，靜止吸附或以0.05-0.2h^-1的稀釋率連續或循環流過載體進行吸附固定化。吸附時間為12-48小時，溫度為30-40℃。固定化后的細胞可用于反應器連續生產丙酮丁醇。

本發明在工業化連續生產時，向反應器中的載體柱中連續通入指數生長期的產丁醇梭菌細胞培養液，稀釋率在0.2-2h^-1之間，可穩定生產15-30天，細胞富集濃度達到20-60g/l，溶劑生產速率可達6g/l·h^-1，與游離發酵水平相比，具有明顯提升。

本發明的細胞固定化載體，使用與處理后的玉米秸稈來固定化產溶劑微生物。使用該固定化方法，不僅能夠提供效率高，使用期長的固定化細胞連續反應器，而且材料便于降解，結合目前的纖維素燃料丁醇生產，廢棄的固定化載體還能夠水解處理，為丁醇發酵提供碳源和氮源。

具體實施方式

實施例1