[發(fā)明專利]產纖維素酶的菌劑及其應用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910076651.8
• 申請日: 2009-01-12
• 公開（公告）號: CN101463330A
• 公開（公告）日: 2009-06-24
• 發(fā)明（設計）人: 吳培均;李卓夫;李富偉;段文娟
• 申請（專利權）人: 北京挑戰(zhàn)生物技術有限公司
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N9/46;C12N9/42;C12N15/56;C12R1/84
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司
• 代理人: 關 暢;任鳳華

技術領域

本發(fā)明涉及產纖維素酶的菌劑及其應用。

背景技術

傳統(tǒng)的纖維素酶生產方法主要是在自然界中篩選優(yōu)良產酶菌株，再通過一定的誘變手段，獲得工業(yè)化大規(guī)模生產的產酶菌種。但自然環(huán)境中纖維素的降解是多種微生物協(xié)同完成的，這些微生物相互共生，形成一個降解纖維素的微生態(tài)體系。在特定的生態(tài)系統(tǒng)中，微生物之間互相協(xié)同作用，也互相制約，使得產生的水解纖維素的酶之間的比例處于一種最適降解纖維素的狀態(tài)，而產生纖維素酶的微生物一旦從其小生態(tài)中分離出來，就會破壞這個最佳比例。篩選優(yōu)良菌株時無疑是將其從其生態(tài)環(huán)境中分離出來，所以其產酶能力很難有所突破。目前工業(yè)用纖維素酶的來源主要是好氧絲狀真菌木霉，如里氏木霉、綠色木霉、康寧木霉，但木霉菌發(fā)酵產物中存在多種真菌毒素，有毒性嫌疑；另一方面木霉產的β-葡萄糖苷酶活力很低，致使纖維二糖在反應體系中積累，最終影響酶解效率。微生物合成纖維素酶受誘導和葡萄糖阻遏這兩種機制調控，β-葡萄糖苷酶分解纖維二糖產生寡糖，產生的寡糖屬于微生物易利用的碳源，其又會阻遏纖維素酶的合成。真菌雖然可以分泌大量纖維素酶，其產酶能力較高，酶系較全，但真菌發(fā)酵周期長，易染細菌且不易擴大生產；細菌生產速度雖然快，但產酶水平低。微生物自身會分泌大量非目的酶蛋白，而纖維素酶又難于純化，因此不利于工業(yè)化的生產及應用。傳統(tǒng)的纖維素酶生產方法已經達到了一個瓶頸。

隨著基因工程技術的發(fā)展，越來越多的纖維素酶編碼基因得到克隆，并成功的在大腸桿菌及畢赤酵母等多種表達系統(tǒng)中表達。但由于纖維素的完全水解需要三種酶成分的協(xié)同作用，而常規(guī)的基因工程手段通常可以高效表達一種酶，所以基因工程纖維素酶功能略顯單薄。現(xiàn)有的重組纖維素酶的生產主要有兩種方式，其一是將上述三種纖維素酶單獨生產，應用時再進行組合，其二是構建雞尾式表達體系直接生產復合纖維素酶，不過這兩種方法都有一定的局限性。前一種方法需要將三種酶分別單獨生產，其整個發(fā)酵周期長，儀器設備及占地面積都有較高的要求。而第二種方法同時在一個畢赤酵母中表達三種不同的酶蛋白，其表達量及產量得不到保證，僅有理論研究價值而無實際應用意義。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是提供一種產纖維素酶的菌劑及其應用。

本發(fā)明所提供的產纖維素酶的菌劑，其活性成分為畢赤酵母1413、畢赤酵母1515和畢赤酵母2526；所述畢赤酵母1413是將內切葡聚糖酶基因導入畢赤酵母中獲得的重組菌，所述畢赤酵母1515將外切葡聚糖酶基因導入畢赤酵母中獲得的重組菌，所述畢赤酵母2526是將β-葡萄糖苷酶基因導入畢赤酵母中獲得的重組菌。

其中，所述內切葡聚糖酶可是如下1)或2)的蛋白；所述外切葡聚糖酶可是如下3)或4)的蛋白；所述β-葡萄糖苷酶可是如下5)或6)的蛋白；

1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；

2)在序列表中序列2的氨基酸序列經過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且能水解多糖的由1)衍生的蛋白質；

3)由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質；

4)在序列表中序列4的氨基酸序列經過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且能水解多糖的由3)衍生的蛋白質；

5)由序列表中序列6所示的氨基酸序列組成的蛋白質；

6)在序列表中序列6的氨基酸序列經過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且能水解多糖的由5)衍生的蛋白質。

所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不超過10個氨基酸的取代和/或缺失和/或添加。

為了使序列表中序列2、4或6所示的蛋白便于純化，可在由序列表中序列2、4或6所示的氨基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。

表1.標簽的序列