[發明專利]具有高體內活性的降血壓肽及其制備和純化方法

有效

• 申請號: 200910076204.2
• 申請日: 2009-01-05
• 公開（公告）號: CN101768209A
• 公開（公告）日: 2010-07-07
• 發明（設計）人: 魯軍;任迪峰;王建中;魯勇
• 申請（專利權）人: 北京林業大學
• 主分類號: C07K5/083
• 分類號: C07K5/083;A61K38/06;A61K36/02;A61P9/12;A23L1/29
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技術領域

本發明涉及一種具有高體內降血壓作用的螺旋藻降血壓肽的制備、純化方法，可應用于保健性功能食品及藥品領域。

背景技術

目前全世界有將近十億人口患高血壓，高血壓正成為嚴重威脅人類健康的疾病之一。雖然卡托普利(Captopril)等人工合成血管緊張素轉化酶(ACE)抑制劑具有顯著的降血壓效果，然而這類降血壓藥物屬酶的競爭性抑制劑，它們對酶活性部位的抑制是可逆的，藥物作用時間不長，停藥后會使血壓反彈；而且，這類藥物被吸收和排泄的速度較快，經腎臟排出易損害腎功能，同時也會引起諸多的副作用，例如咳嗽、過敏、皮疹、水腫、心律失常和腎臟損害等，所以研發更為安全的天然來源ACE抑制劑十分必要。

ACE抑制肽的研究在國外從上世紀六、七十年代開始，而在國內則從九十年代后期開始才逐有報道。國內外研究者已從不同的天然食物來源中分離出ACE抑制肽，如蝮蛇、牛奶、金槍魚、酪蛋白等，不同來源的ACE抑制肽在氨基酸數目、序列和活性上均存在較大差異。

螺旋藻為藍藻的一個屬，含有多種營養成分，具有營養及醫療保健功能，被世界糧農組織(FAO)譽為21世紀人類最理想、最完美的食品。螺旋藻中尤以蛋白質含量最為豐富，是大豆蛋白質的兩倍，是目前已知植物中蛋白質含量最高的一種，其中含有18種氨基酸，其中包括人體必需的全部8種氨基酸，是獲得天然活性肽的潛在寶貴資源，但高純度和高活性的螺旋藻源ACE抑制肽目前在國內外尚無報道。此外，螺旋藻主要以干粉形式直接應用食品行業，由于其溶解性質的局限性，不利于人體吸收，使其應用受到一定的限制。本研究采用3種不同種類的?酶及酶解提取、精制技術，獲得了9種ACE抑制肽，其中纈氨酸(valine)-谷氨酸(glutamic?acid)-脯氨酸(proline)(Val-Glu-Pro，VEP)肽IC50＝27.36±0.14μM，Ki＝23.59±0.54μM，其成果可廣泛應用于保健性功能食品及藥品領域，具有巨大的實用價值和經濟效益。

發明內容

本發明的目的是克服大分子蛋白質吸收性差以及目前活性肽品種混雜不清、活性和純度不高方面的不足，獲得一種具有高體內降血壓作用的螺旋藻降血壓肽的制備方法。

為實現上述目的，本發明采用超低溫凍融與超聲波破碎相結合的方法從螺旋藻粉末中提取蛋白，再利用木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶或嗜熱菌蛋白酶進行不同條件的酶解，將以上3種酶水解所獲產物經不同分子量大小的超濾膜MWCO?10000、5000、3000過濾，獲得具有不同分子量多肽的濾液，以體外ACE抑制活性為指標，通過凝膠過濾色譜、反相高效液相色譜對所提取多肽進行純化，純化后的多肽使用PPSQ-31A/33A系列全自動蛋白多肽序列分析儀和Kratos?Analytical?Shimadzu質譜分析儀進行鑒定。活性肽的體內降血壓效果通過動物實驗進行驗證，并應用分子生物學和免疫學等手段檢測相關調控因子的基因和蛋白表達，分析其體內作用機制，證實具有良好的體內降血壓效果，可應用于保健性功能食品及藥品領域。

此種具有高體內降血壓作用的螺旋藻降血壓肽的制備，也可利用肽自動合成儀通過多肽合成方法人工合成。

附圖說明

下面對附圖進行簡要說明。

圖1是Superdex?Peptide?HR?10/30凝膠過濾色譜圖。橫坐標軸表示分離各管的試管號，縱坐標表示各管在220nm處的吸光度值。

圖2是Cosmosil?MS-II?C18柱反相高效液相色譜圖，(a)表示第一次分離曲線圖，(b)表示第二次分離曲線圖。橫坐標軸表示分離各管的試管號，縱坐標軸表示各管在220nm處的吸光度值。

圖3是ACE抑制肽的質譜圖。

圖4是抑制劑類型圖。(a)表示Lineweaver-Burk圖，橫坐標軸表示基質濃度的倒數，縱坐標軸表示反應速度的倒數；(b)表示Dixon圖，橫坐標軸表示抑制劑的濃度，縱坐標軸表示反應速度的倒數。

圖5是Hydrosphere?C18柱反相高效液相色譜圖。(a)表示未經消化酶消化的色譜圖，(b)表示經胃蛋白酶消化的色譜圖，(c)表示經胰凝乳蛋白酶消化的色譜圖，(d)表示經胰蛋白酶消化的色譜圖，(e)表示經胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶及胰蛋白酶消化的色譜圖。橫坐標軸表示時間，縱坐標軸表示吸光度值。

具體實施方式

以下結合附圖和具體實施例對本發明作進一步的詳細描述，但并不限制本發明的范圍。其具體工藝路線由以下步驟構成：