[發(fā)明專利]人肝素酶cDNA表達載體在制備抗人肝素酶免疫抗體中的應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910076127.0
• 申請日: 2009-01-07
• 公開（公告）號: CN101457232A
• 公開（公告）日: 2009-06-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 宮鋒;宋海峰;李素波;高新;高紅偉;田曙光;虞立霞;檀英霞
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C07K16/40;C07K16/06;G01N33/573;G01N33/543
• 代理公司: 北京尚誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 邸萬杰

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及人肝素酶cDNA表達載體的新用途，特別是涉及人肝素酶cDNA表達載 體在制備抗人肝素酶免疫抗體中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

硫酸肝素，即線形陰離子糖胺聚糖，廣泛存在于各種細胞表面，介導(dǎo)蛋白質(zhì)之間 的相互作用，如參與細胞因子(FGF-1，2、HGF、TGFβ、PDGF)與受體的結(jié)合，調(diào)節(jié)抗 凝血酶與凝血酶之間的作用，并且還是細胞間質(zhì)和血管內(nèi)皮下基底膜的重要組成部 分。在腫瘤形成過程中，細胞外間質(zhì)包裹腫瘤形成的與正常組織的分隔，以及血管內(nèi) 皮下的基底膜構(gòu)成了阻止腫瘤向相鄰組織浸潤和血行轉(zhuǎn)移的生理屏障。

肝素酶(heparanase)—β-1，4葡萄糖苷內(nèi)切酶，特異性地作用于硫酸肝素的 特定位點，將其降解為小分子片段(Hulett?MD，F(xiàn)reeman?C，Hamdorf?BF，et?al. Cloning?of?mammalian?heparanase，an?important?enzyme?in?tumor?invasion?and metastasis.Nat?Med?1999；5(7)：803-9；Vlodavaky?I，F(xiàn)riedmann?Y，Elkin?M，et al.Mammalian?heparanase：gene?cloning，expression?and?function?in?tumor progression?and?metastasis.Nat?Med?1999；5：793-802)。有關(guān)肝素酶的研究已 二十余年，研究表明肝素酶對機體的發(fā)育、炎癥過程、血管生成、腫瘤轉(zhuǎn)移均有重要 的作用(Eccles?SA.Heparanase：breaking?down?barriers?in?tumors.Nat?Med. 19995(7)：73573-6)。目前被人們普遍關(guān)注的是惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展均伴有肝素酶 的高表達，這意味著①基底膜的完整性遭到破壞，腫瘤細胞將突破局限轉(zhuǎn)移至它處或 穿透基底膜進入血管。②肝素酶促血管生成作用為侵襲、轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞提供了定居、 生長所需營養(yǎng)。因此，肝素酶對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有重要作用。肝素酶降解血管基 底膜中的硫酸肝素，使基底膜通透性增加，是肝素酶參與炎癥反應(yīng)的機理，當(dāng)肝素酶 超表達時將引發(fā)自身免疫性疾病。由此可見，肝素酶與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移以及 自身免疫性疾病密切相關(guān)。

目前，國內(nèi)外尚無有關(guān)檢測血清中肝素酶水平的報導(dǎo)，對腫瘤組織中肝素酶表達 水平的檢測尚處在研究階段，因此建立一種靈敏的肝素酶水平檢測方法凸顯重要。此 外，以肝素酶單抗作為導(dǎo)向的抗腫瘤藥也正處于研發(fā)之中。實現(xiàn)上述目的的關(guān)鍵是制 備高特異性的肝素酶抗體。現(xiàn)今，商品化的肝素酶抗體生產(chǎn)方法均為用蛋白免疫獲得 的多克隆抗體及雜交瘤法生產(chǎn)的單克隆抗體。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種人肝素酶cDNA表達載體的新用途，即在制備抗人肝素酶免疫 抗體中的應(yīng)用。

所述人肝素酶cDNA表達載體，是含有人肝素酶全長編碼cDNA的重組表達載體。

所述人肝素酶全長編碼cDNA可插入到重組表達載體中。構(gòu)建所述重組表達載體 的出發(fā)載體，可為任意一種指本領(lǐng)域熟知的可進行外源基因表達的載體。總之，只要 能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定表達，任何載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常 含有復(fù)制點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。

所述原核表達載體可為pET-32a、pET-28a、pET-28b、pET-28c、pET-21a(+)或 pET-30a等；所述真核表達載體可為pcDNA、pVAX1、pCMV5、pSilence1.0-U6(Ambion， Austin，TX，USA)、pEGFP-N1、pSV40、pCI-neo(購于Promega公司)、pTEF1、pPICZα、 pAM82或pAAh5等，優(yōu)選為pcDNA3.1。

其中，以pcDNA3.1為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有所述人肝素酶cDNA的重組表達載體 為pcDNA3.1-HPSE。