[發明專利]全蝎的活性成分及其應用

有效

• 申請號: 200910074135.1
• 申請日: 2009-04-14
• 公開（公告）號: CN101862350A
• 公開（公告）日: 2010-10-20
• 發明（設計）人: 許文博;王玉蓉;黃能聽;趙韶華;張玉杰
• 申請（專利權）人: 河北以嶺醫藥研究院有限公司
• 主分類號: A61K35/64
• 分類號: A61K35/64;A61P7/02;A61K38/02
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技術領域

本發明涉及到兩種全蝎抗凝血和溶栓的活性成分及其提取分離方法，特別地，涉及仿生酶解的提取方法和凝膠過濾層析分離純化方法。

背景技術

全蝎(Bathus?ma?rtensii?kansch)系鉗蝎科節肢動物干燥物，性辛，味平，有毒，歸肝經。具有通絡止痛、熄風止痙、攻毒散瘀等作用，為臨床常用的抗腫瘤藥，已有研究表明活體全蝎的主要有效成分為蝎毒，藥材中有效成分仍不清楚，因此目前多以全粉末入藥，存在著劑量大，易造成微生物污染等弊病。鑒于動物類蛋白質、粘多糖等大分子物質只有到達胃腸道后受消化酶、酸、堿等作用，方可被酶解或者水解成小分子的肽、低聚糖和其他小分子物質，吸收入血而發生藥效，故生物酶仿生提取方法模擬體內消化過程，提取的有效成分治療效果更佳。

凝膠過濾層析又稱為大小排阻、凝膠排阻、分子篩或凝膠過濾層析，根據蛋白質分子大小不同而達到分離效果，凝膠過濾填料中含有大量微孔，只允許緩沖液及小分子量蛋白質或肽類通過，而大分子蛋白質及一些蛋白復合物則被阻擋在外；高分子量的肽類在填料顆粒間隙中流動，比低分子量肽類更早地被洗脫下來，達到分級分離的目的，且可降低因不可逆結合所致的蛋白質損失或失活。

發明內容

本發明目的是提供兩種全蝎抗凝血和溶栓的活性成分和其提取分離方法及其應用。

本發明提供了兩種全蝎抗凝血和溶栓的活性成分，一種活性成分是經胃蛋白酶解得到的產物，另一種活性成分是先經胃蛋白酶解，然后再經胰蛋白酶解得到的產物。

優選地，所述胃蛋白酶解產物中抗凝血的活性成分為小分子肽類。

更優選地，所述小分子肽類是分子量為850-5300的小分子肽類。

本發明還提供了兩種活性成分的提取方法，它是由以下步驟組成的：

(1)全蝎藥材細粉加入人工胃液，密閉，于37℃恒溫水浴作用30分鐘后，加入3.0％胃蛋白酶水解3小時，將酶解液置于85℃恒溫水浴作用15分鐘，冷卻至室溫，以4200r/min離心15分鐘，取上清液，干燥得全蝎胃蛋白酶酶解物；

(2)將步驟(1)所得沉淀干燥，繼加入20倍量人工腸液，密閉，于37℃恒溫水浴作用30分鐘后，加入5％胰蛋白酶水解4小時，將酶解液于85℃恒溫水浴作用15分鐘，冷卻至室溫，以4200r/min離心15分鐘，取上清液，干燥得全蝎胰蛋白酶酶解物。

優選地，所述步驟(1)中全蝎細粉和人工胃液的固液重量體積份比例為1∶20。

本發明還提供了全蝎胃蛋白酶解成分的分離純化方法，它是由以下步驟組成的：

(1)填料的預處理：分別稱取適量葡聚糖凝膠，加大體積水煮沸1小時，自然冷卻至室溫，反復傾倒上清液以除去懸浮破碎顆粒；

(2)安裝層析柱：層析柱規格為10mm×30cm，清洗所有組件，垂直安裝在鐵架臺上，關閉底部活塞；

(3)填裝：懸浮填料，使用玻璃棒沿壁連續緩緩注入填料，并用水灌滿層析柱，打開底部活塞，沖柱至柱體積恒定，用3倍柱體積磷酸緩沖溶液沖柱；

(4)上樣：全蝎藥材細粉加入人工胃液，密閉，于37℃恒溫水浴作用30分鐘后，加入3.0％胃蛋白酶水解3小時，將酶解液置于85℃恒溫水浴作用15分鐘，冷卻至室溫，以4200r/min離心15分鐘，取上清液，調整濃度至20mg/mL，上樣2mL，不超過柱體積的10％；

(5)洗脫：用磷酸緩沖溶液洗柱，流速1.0mL/min，分管收集；

(6)樣品檢測：①280納米光吸收法：在紫外280nm波長處測定蛋白質含量；②考馬斯亮蘭G-250法：在檢測波長595nm處測定蛋白質含量。

全蝎仿生酶解產物抗凝血和溶栓活性評價：

本發明采用活化部分凝血酶時間法(APTT法)和纖維蛋白原平板法對活性成分的抗凝血和溶栓效果進行評價，評價方法如下：

1材料

1.1藥材

全蝎為全蟲干燥體(河北以嶺醫藥研究院有限公司提供)，置干燥箱60℃以下干燥，粉碎成細粉，備用。

1.2試劑

牛纖維蛋白原(Sigma?F8630，購自北京環亞泰克生物醫學技術有限公司)；胰蛋白酶1∶250(Amresco0458，購自北京華美轉導科技有限公司)；胃蛋白酶1∶10000(Sigma?P7000，購自北京環亞泰克生物醫學技術有限公司)；醫用注射性尿激酶(購自北京市望京醫院)；凝血酶(Sigma?T4648，購自北京環亞泰克生物醫學技術有限公司)；活化部分凝血酶時間(APTT)試劑10*1.5ml(購自上海太陽生物試劑公司)；三氯乙酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；乙醇(分析純)。