[發(fā)明專利]哲羅鮭微衛(wèi)星序列與多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記的獲取方法和哲羅鮭多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910073115.2
• 申請(qǐng)日: 2009-10-29
• 公開（公告）號(hào): CN101736084A
• 公開（公告）日: 2010-06-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 匡友誼;佟廣香;尹家勝;孫效文
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11;C12P19/34;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標(biāo)事務(wù)所 23109
• 代理人: 何強(qiáng)

1.哲羅鮭微衛(wèi)星序列的獲取方法，其特征在于哲羅鮭微衛(wèi)星序列按以下 步驟獲得：一、提取哲羅鮭基因組DNA；二、哲羅鮭基因組DNA的酶切和微 衛(wèi)星富集文庫(kù)的構(gòu)建；三、菌落PCR擴(kuò)增并進(jìn)行陽(yáng)性克隆檢測(cè)和測(cè)序，即獲 得哲羅鮭微衛(wèi)星序列；步驟二中采用限制性內(nèi)切酶單酶切或雙酶切哲羅鮭基因 組DNA；

其中，步驟二分以下步驟實(shí)現(xiàn)：

a、哲羅鮭基因組DNA的酶切：

哲羅鮭基因組DNA酶切體系為20μL，由2μL?10×酶切buffer、0.2μL濃 度為10ng/μL的BSA、2.5U限制性內(nèi)切酶、5μL濃度為100ng/μL的哲羅鮭基 因組DNA和余量的滅菌去離子水組成；酶切孵育時(shí)間為4h；

b、連接：

連接體系為40μL，由20μL步驟a酶切片段、2μL粘末端雙鏈接頭、4μL 10×buffer、6weiss單位T4?DNA連接酶和余量的滅菌去離子水組成，并于4℃ 水浴中過夜連接；其中雙鏈接頭按以下步驟制備：等體積混合濃度均為 10pmol/L的單鏈寡核苷酸連接頭A和單鏈寡核苷酸連接頭B，95℃變性10min， 然后經(jīng)過4h勻速冷卻至10℃，即得到雙鏈接頭；

c、目的片段獲取：

用單鏈寡核苷酸連接頭A做擴(kuò)增引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)體系為25μL， 由3μL步驟b連接產(chǎn)物、1.5μL引物、2.5μL?10×Buffer、1.5μL濃度為25mmol/L 的MgCl₂、2μL濃度為2.5mmol/L的dNTP、0.3μL濃度為5U/μL的Taq酶和 余量的無(wú)菌超純水組成；擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?2℃2min，94℃預(yù)變性5min，循 環(huán)設(shè)置為94℃變性30s、53℃退火30s、72℃延伸1min，共14～20個(gè)循環(huán)，72℃ 延伸10min；擴(kuò)增產(chǎn)物用濃度為1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用Promega?PCR 產(chǎn)物回收試劑盒切膠回收長(zhǎng)度為500～900bp的DNA片段；

d、微衛(wèi)星富集文庫(kù)的構(gòu)建：

I、雜交

取12μL步驟c回收的DNA片段置于95℃環(huán)境中變性10min，然后立即 加入到68℃、體積為38μL的雜交液中雜交1h后得到雜交DNA；其中38μL 的雜交液由1.5μL濃度為10μmol/L的生物素標(biāo)記的含有重復(fù)序列的探針、5μL 濃度為10pmol/L的單鏈寡核苷酸連接頭A，15μL?20×SSC，0.5μL質(zhì)量濃度為 10％的SDS和16μL?ddH₂O組成；

II、平衡磁珠

在1.0mL離心管中加入100μL鏈霉親和素磁珠和200μL洗液C洗滌2次， 然后將離心管放在磁力架上使磁珠吸附在管壁上，棄除上清液，再用200μL 洗液D洗滌磁珠3～5次，之后加入150μL洗液D室溫放置，即得到平衡磁珠； 洗液C中pH值為8.0時(shí)EDTA?的濃度為1mmol/L、pH值為8.0的Tris-Cl的 濃度為10mmol/L、NaCl的濃度為2mmol/L；洗液D是用6×SSC液稀釋的質(zhì) 量濃度為0.1％的SDS溶液；

III、親和捕捉

將步驟I得到的雜交DNA加入步驟II平衡磁珠中25℃溫浴20min，然后 去除上清液，再用洗液D25℃洗滌磁珠2次，每次10min，之后用洗液E?68℃ 洗滌磁珠2次，再用洗液F洗滌磁珠2次，而后用200μL?0.1×TE洗滌磁珠2 次，再加入30μL?0.1×TE在95℃變性10min，然后收集上清液，即得到含有重 復(fù)序列的單鏈DNA片段；其中洗液E是用3×SSC液稀釋的質(zhì)量濃度為0.1％ 的SDS溶液，洗液F為6×SSC液；

IV、PCR擴(kuò)增含有微衛(wèi)星序列的DNA片段

PCR反應(yīng)體系為25μL，由內(nèi)含4種dNTP的混合PCR緩沖液18μL、單 鏈寡核苷酸連接頭A為引物0.5μL、Taq?DNA聚合酶0.5μL，步驟III收集的上 清液4μL和余量的無(wú)菌水組成；PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，循 環(huán)設(shè)置為94℃變性30s、53℃退火30s、72℃延伸1min，共20～30個(gè)循環(huán)，72℃ 延伸10min，用Promega?PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化回收，去除多余的引物、dNTP 和接頭；

V、T-載體連接及克隆

T-載體連接反應(yīng)體系為10μL，由5μL?T-載體商業(yè)包裝中2×連接緩沖液、 1μL載體pMD18-T?vector和4μL步驟IV純化回收的DNA片段組成；同時(shí)以T 載體自身連接作為對(duì)照，4℃連接過夜；再用CaCl₂制備的感受態(tài)大腸桿菌 DH5α進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到基因組微衛(wèi)星富集文庫(kù)，并將文庫(kù)中的單菌落轉(zhuǎn)移培養(yǎng) 平板中按順序排列；

步驟二d?I中生物素標(biāo)記的含有重復(fù)序列的探針為生物素標(biāo)記的(CA)₁₆寡 核苷酸探針或生物素標(biāo)記的(CAG)₁₆寡核苷酸探針；

步驟二a中限制性內(nèi)切酶為限制性內(nèi)切酶Tsp509I、限制性內(nèi)切酶Tru9I、 限制性內(nèi)切酶CviQI、限制性內(nèi)切酶BfaI、限制性內(nèi)切酶Sau3AI或限制性內(nèi) 切酶TaqI；步驟二中使用限制性內(nèi)切酶Tsp509I其單鏈寡核苷酸連接頭A的堿 基序列為5′-CTCGTAGACTGCGTACC-3′，單鏈寡核苷酸連接頭B的堿基序列 為5′-AATTGGTACGCAGTCTAC-3′；使用限制性內(nèi)切酶Tru9I、CviQI或BfaI 其單鏈寡核苷酸連接頭A的堿基序列為5′-GACGATGAGTCCTGAG-3′，單鏈 寡核苷酸連接頭B的堿基序列為5′-TACTCAGGACTCAT-3′；使用限制性內(nèi)切 酶Sau3AI其單鏈寡核苷酸連接頭A的堿基序列為 5′-GATCGTCGACGGTACCGAATTCT-3′，單鏈寡核苷酸連接頭B的堿基序列 為5′-CAGCTGCCATGGCTTAAGAACTG-3′；使用限制性內(nèi)切酶TaqI其單鏈寡 核苷酸連接頭A的堿基序列為5′-GACGATGAGTCCTGAG-3′，單鏈寡核苷酸 連接頭B的堿基序列為5′-CGCTCAGGACTCAT-3′；

步驟三中用通用引物M13+或M13-與含有重復(fù)序列的探針為引物進(jìn)行菌 落PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為15μL，由0.6μL濃度為10μmol/L的正向引物、 0.6μL濃度為10μmol/L的反向引物、1.5μL?Taq?DNA聚合酶商業(yè)包裝中 10×Buffer、0.9μL濃度為25mmol/L的MgCl₂、1.2μL濃度為2.5mmol/L的dNTP、 0.12μL濃度為5U/μL的Taq?DNA聚合酶和余量的無(wú)菌去離子水組成；用無(wú)菌 牙簽按順序?qū)尉涮羧敕磻?yīng)管中進(jìn)行菌落PCR，PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變 性5min，94℃變性30s、60℃退火30s、72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)，72℃ 延伸5min，PCR反應(yīng)產(chǎn)物用濃度為1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，挑取PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物為200～750bp的具有明顯條帶的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序；

步驟二d?I中選用生物素標(biāo)記的(CA)₁₆寡核苷酸探針，則步驟三PCR擴(kuò)增 引物為M13+和(CA)₁₀，或者M(jìn)13-和(CA)₁₀；步驟二d?I中選用生物素標(biāo)記的 (CAG)₁₆寡核苷酸探針則步驟三PCR擴(kuò)增引物為M13+和(CAG)₆，或者M(jìn)13- 和(CAG)₆。