[發明專利]產氫產乙酸細菌互營共培養體的分離篩選方法

無效

• 申請號: 200910072294.8
• 申請日: 2009-06-15
• 公開（公告）號: CN101570737A
• 公開（公告）日: 2009-11-04
• 發明（設計）人: 劉楓;李建政;昌盛
• 申請（專利權）人: 哈爾濱工業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所
• 代理人: 金永煥

1、產氫產乙酸細菌互營共培養體的分離篩選方法，其特征在于產氫產乙酸細菌互營共培養體的分離篩選方法按以下步驟實現：一、將具有完整甲烷發酵功能的厭氧活性污泥放入裝有數顆玻璃珠的滅菌血清瓶中，通入氮氣后封口，而后在溫度為35℃、振蕩速率為100～200r/min的條件下振蕩處理1～3h；二、將經步驟一振蕩培養后的厭氧活性污泥接種到裝有富集培養基的滅菌血清瓶中，然后在溫度為35℃、振蕩速率為100～200r/min的條件恒溫培養1～3個月；三、按接種量為10％～20％(V/V)將富集培養液接種到液體培養基上培養1～3個月；四、重復操作步驟三至液體培養基對富集培養液降解速率與甲烷產量達到穩定為止，得菌懸液A；五、在氮氣環境中，取1mL菌懸液A用無菌厭氧水倍比稀釋，然后將1mL經倍比稀釋的菌懸液A接種于固體培養基上，而后在35℃的條件下恒溫培養至固體培養基上有菌落出現；六、挑取單菌落放在液體培養基中，然后在溫度為35℃、振蕩速率為100～200r/min的條件恒溫培養至有乙酸、甲烷、氫氣和二氧化碳產生，得菌懸液B；七、取1mL菌懸液B用無菌厭氧水倍比稀釋，然后將1mL經倍比稀釋的菌懸液B接種于固體培養基上，而后在35℃的條件下恒溫培養至固體培養基上有菌落出現；八、重復步驟六到步驟七25～30次，即可分離篩選出產氫產乙酸細菌互營共培養體。

2、根據權利要求1所述的產氫產乙酸細菌互營共培養體的分離篩選方法，其特征在于步驟一中氮氣的純度為99.99％。

3、根據權利要求1或2所述的產氫產乙酸細菌互營共培養體的分離篩選方法，其特征在于步驟一中以130r/min的振速振蕩2h。

4、根據權利要求3所述的產氫產乙酸細菌互營共培養體的分離篩選方法，其特征在于步驟二中富集培養基每1000mL由20g的丁酸鈉、20g的丙酸鈉、10mL的微量元素液、10mL的維生素溶液、20mL的瘤胃液、30mL的無菌發酵上清液、50mL的礦質元素液、1.0g的酵母膏、濃度為0.2％(w/v)的刃天青2滴、0.5g的半胱氨酸、1.96g的氯化鈣和余量的蒸餾水組成，pH為7.0。

5、根據權利要求4所述的產氫產乙酸細菌互營共培養體的分離篩選方法，其特征在于微量元素液由0.1g的ZnSO₄·7H₂O、0.03g的MnCl₂·4H₂O、0.3g的H₃BO₃、0.2g的CoCl₂·6H₂O、0.01g的CaCI₂·2H₂O、0.02g的NiCI₂·6H₂O、0.03g的Na₂MoO₄·2H₂O和0.15g的FeCl₂·4H₂O溶于1000mL的蒸餾水組成。

6、根據權利要求4所述的產氫產乙酸細菌互營共培養體的分離篩選方法，其特征在于維生素溶液由20mg的煙酸、10mg的維生素B₁、10mg的對氨基苯甲酸、50mg的維生素B₆、2mg的維生素H、2mg的葉酸、10mg的鹽酸吡哆醇、5mg的核黃素B₂和5mg硫胺素溶于1000mL蒸餾水組成。

7、根據權利要求4所述的產氫產乙酸細菌互營共培養體的分離篩選方法，其特征在于瘤胃液由牛解剖1～2h內取得的牛瘤胃液，然后經過兩層紗布過濾，而后以速度為5000r/min離心15min后取上清液而得。

8、根據權利要求4所述的產氫產乙酸細菌互營共培養體的分離篩選方法，其特征在于礦質元素液由10.0g的KH₂PO₄、6.6g的MgCl₂·6H₂O、8.0g的NaCl、8.0g的NH₄Cl和1.0g的CaCl₂·2H₂O溶于1000mL的蒸餾水組成。