[發(fā)明專(zhuān)利]一種厭氧反硝化細(xì)菌的快速分離方法及所用到的特異性引物

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910071694.7
• 申請(qǐng)日: 2009-04-01
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101519643A
• 公開(kāi)（公告）日: 2009-09-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡建民;王月媛;魏利
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 哈爾濱師范大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/20
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/20;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專(zhuān)利商標(biāo)事務(wù)所
• 代理人: 金永煥

1.一種厭氧反硝化細(xì)菌的快速分離方法，其特征在于厭氧反硝化細(xì)菌的快速分離方法按以下步驟實(shí)現(xiàn)：一、采用DNA抽提試劑盒提取樣品中微生物的DNA，然后采用特異性引物對(duì)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選擇含有厭氧反硝化細(xì)菌的樣品，然后接種于厭氧菌液態(tài)培養(yǎng)基中，采用Hungate厭氧操作技術(shù)進(jìn)行厭氧反硝化細(xì)菌的分離培養(yǎng)，然后對(duì)分離培養(yǎng)得到的菌進(jìn)行檢驗(yàn)，初篩出厭氧反硝化細(xì)菌；二、將初篩得到的厭氧反硝化細(xì)菌接種于厭氧菌固體培養(yǎng)基中，制成滾管進(jìn)行厭氧反硝化細(xì)菌的純化培養(yǎng)至長(zhǎng)出菌落；三、在厭氧工作箱中挑取單菌落接種于厭氧菌液體培養(yǎng)基中進(jìn)行富集培養(yǎng)7～14天得菌液，然后采用特異性引物對(duì)菌液中細(xì)菌的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，復(fù)篩出厭氧反硝化細(xì)菌；四、對(duì)復(fù)篩得到的厭氧反硝化細(xì)菌的菌液，依次進(jìn)行分離培養(yǎng)、純化培養(yǎng)和富集培養(yǎng)，然后對(duì)富集培養(yǎng)的菌液進(jìn)行鏡檢和革蘭氏染色，再采用特異性引物對(duì)菌液中細(xì)菌的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，去除重復(fù)菌株，然后重復(fù)操作分離培養(yǎng)和純化培養(yǎng)至獲得純菌株，即完成厭氧反硝化細(xì)菌的快速分離；其中步驟一中PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)熱5min、94℃變性30s、55.9℃復(fù)性45s、72℃延伸90s、循環(huán)30次和72℃延伸10min；特異性引物為上游特異性引物5’-GC[T/C][C/T]ACCAAG[G/C]CGACGATC-3’，下游特異性引物5’-ACCAGGGTATCTAATCCTG-3’；步驟一中PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下：

10×PCR?Buffer??????????????2μL

dNTPs?0.3mmol/L?????????????2μL

上游引物0.1μmol/L??????????1μL

下游引物0.1μmol/L??????????1μL

rTaq?E?0.3U/μL?????????????0.3μL

DNA樣品2μg/L???????????????2μL

補(bǔ)足dH₂O????????????????????至20μL；

步驟一中厭氧菌液態(tài)培養(yǎng)基由2.0g的KNO₃、2.0g的NaNO₃，0.03g的MgSO₄·7H₂O、0.5g的K₂HPO₄、10g的酒石酸鉀鈉、1.0g的KH₂PO₄、0.5g的FeCl₂·6H₂O、0.2g的CaCl₂·2H₂O和1750mL的蒸餾水組成，pH＝7.5；步驟二中厭氧菌固體培養(yǎng)基由2.0g的KNO₃、2.0g的NaNO₃、0.03g的MgSO₄·7H₂O、0.5g的K₂HPO₄、10g的酒石酸鉀鈉、1.0g的KH₂PO₄、0.5g的FeCl₂·6H₂O、0.2g的CaCl₂·2H₂O、12g瓊脂粉和1750mL的蒸餾水組成，pH＝7.5；步驟一和步驟三中厭氧菌液態(tài)培養(yǎng)基成分相同；步驟三和步驟四中采用特異性引物對(duì)菌液中細(xì)菌的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用的方法與步驟一中的相同。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種厭氧反硝化細(xì)菌的快速分離方法，其特征在于步驟二中厭氧菌固體培養(yǎng)基的成分配置好后放入到電磁鍋中，煮沸后加入L-半胱氨酸0.5g和質(zhì)量濃度為0.2％的刃天青溶液指示劑此時(shí)有氧氣存在，培養(yǎng)基的顏色為粉紅色，不斷加熱煮沸，蓋上鍋蓋，通入質(zhì)量純度為99.99％的氮?dú)怛?qū)氧30～40min，直至培養(yǎng)基由粉紅色變成無(wú)色，然后厭氧管分裝，在121℃的條件下滅菌20min。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種厭氧反硝化細(xì)菌的快速分離方法，其特征在于步驟三中富集培養(yǎng)8～12天。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種厭氧反硝化細(xì)菌的快速分離方法，其特征在于步驟三中富集培養(yǎng)10天。