[發(fā)明專利]表達傳染性胰腺壞死病毒VP3蛋白的重組干酪乳桿菌及制法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910071262.6
• 申請日: 2009-01-14
• 公開（公告）號: CN101525589A
• 公開（公告）日: 2009-09-09
• 發(fā)明（設計）人: 劉敏;李一經;趙麗麗;趙永欣;劉巍巍
• 申請（專利權）人: 東北農業(yè)大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/34;C12N15/74;C12R1/245
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

(一)技術領域

本發(fā)明涉及的是生物制品，本發(fā)明還涉及這種生物制品的制備方法。具體地說是表達傳染性胰腺壞死病毒VP3蛋白的重組干酪乳桿菌及制法。

(二)技術背景

傳染性胰腺壞死是由傳染性胰腺壞死病病毒(Infectious?pancreas?necrosis?virus，IPNV)引起鮭科魚類的一種高度傳染性和急性病毒性疾病，典型癥狀為游動異常，病魚體色深暗，腹部膨脹，眼球突出，皮下、肝胰腺等內臟實質器官出血壞死，高致病力毒株對兩月齡的幼魚致死率高達90％，感染后幸存的魚終生帶毒，通過糞便和精卵排出病原，成為潛在的傳染源。因該病流行范圍廣，發(fā)病和致死率高，給我國和世界各國鮭鱒養(yǎng)殖業(yè)帶來重大的經濟損失。疫苗免疫接種是預防本病的主要措施。IPNV主要經皮膚、消化道和鰓感染鮭科魚類，局部的黏膜免疫是傳染性胰腺壞死特異性免疫應答的主要特征，魚腸道、鰓黏膜表面Ig含量的高低直接決定IPN的發(fā)生與否和疾病表現的嚴重程度。而針對本病黏膜免疫特點，采用口服免疫是較為理想的預防途徑。因此選擇安全無毒，能夠在腸道中存活并能表達和傳遞抗原物質的載體系統(tǒng)，有效的刺激黏膜免疫系統(tǒng)所產生的黏膜免疫應答對本病的防治具有重要意義。

IPNV有兩種主要結構蛋白，分別為外衣殼蛋白VP2和內衣殼蛋白VP3。已證明VP2蛋白是產生免疫保護的重要抗原，最新研究也表明，針對IPNV?VP3蛋白的血清抗體，能夠在細胞水平上中和病毒的細胞病變效應，與VP2比較其免疫原性更強。表明VP3蛋白亦含有重要的中和抗原表位。一般認為VP3蛋白是作為IPNV的內衣殼蛋白參與病毒粒子的組成，但Tarrab等利用抗VP3單克隆抗體檢測到IPNV病毒粒子表面存在部分VP3蛋白，Park等的試驗表明，VP3蛋白含有重要的中和表位。因此，由VP3基因編碼的蛋白和VP2蛋白一樣具有重要的免疫學功能，因此，由VP3基因編碼的蛋白和VP2蛋白一樣具有重要的免疫學功能。目前報道的用于IPNV?VP3蛋白的表達主要宿主菌是大腸桿菌和酵母。大腸桿菌是一類應用最為廣泛的表達異源蛋白的宿主菌，因為大腸桿菌生長速度快，并且具有良好代表性的遺傳學特征，目前仍然廣泛被應用來表達異源蛋白，但是在大腸桿菌中表達的融合蛋白以不溶的包涵體形式存在，不具有生物活性，并且大腸桿菌含有有毒的細胞致熱源，因此其表達產物需要做廣泛的檢測后才能被使用。酵母普遍被認為是食品級安全的表達宿主具有大腸桿菌所沒有的優(yōu)點，但是融合蛋白產量又很低，并且酵母菌表達的目的蛋白需將酵母細胞壁破碎后才能口服免疫魚，均不能作為活的載體系統(tǒng)來傳遞完整無損的抗原成分。

(三)發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種能夠用于防治傳染性胰腺壞死的安全、有效的黏膜免疫活菌疫苗，即表達傳染性胰腺壞死病毒(Infectious?pancreas?necrosis?virus，IPNV)VP3蛋白的重組干酪乳桿菌及其制法。

(一)要解決的技術問題

本發(fā)明的目的是這樣實現的：

它是保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏號為CCTCC?NO：M?209004，命名為pPG1-IPNVVP3/Lactobacillus?casei?393的重組干酪乳桿菌，保藏日期2009年1月6日。

根據傳染性胰腺壞死病毒VP3蛋白的全基因序列及表達載體質粒的基因融合特點，設計一對引物，進行PCR，獲得含有IPNV?VP3基因主要抗原位點的618bp目的片段(圖1)，將擴增得到的IPNV?VP3基因克隆到質粒pMD18-T中(圖2)，并轉化于大腸桿菌JM109菌株中，得到pMD18-T-IPNV?VP3/JM109，將pMD18-T-IPNV?VP3雙酶切回收的VP3與表面表達的載體質粒pPG1進行連接，通過電轉化進入宿主菌干酪乳桿菌Lactobacillus?casei?393細胞內，含陽性重組質粒pPG1-IPNV?VP3的干酪乳桿菌命名為pPG1-IPNV?VP3/L.casei393。將重組pPG1-IPNV?VP3/L.casei?393在乳糖的誘導下進行表達。

擴增獲得IPNV?VP3基因cDNA序列為：

上、下游引物序列分別：

P1?5′AGC?GGATCC?T?GCATCCGGGATGGACGAG?3′

P2?5′AGC?CTCGAG?TCGTCGTTTCATCTGTC?3′。

(二)技術方案

采用本發(fā)明的方法獲得的產物經檢驗結果為：

1.干酪乳桿菌表達載體的酶切鑒定結果