[發明專利]根癌農桿菌介導的甘油氧化酶高產菌株的轉化及篩選方法

無效

• 申請號: 200910070996.2
• 申請日: 2009-10-28
• 公開（公告）號: CN102051333A
• 公開（公告）日: 2011-05-11
• 發明（設計）人: 李明春;魏東盛;楊哲;郭慧;邢來君
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C12N15/80;C12R1/66
• 代理公司: 天津佳盟知識產權代理有限公司 12002
• 代理人: 侯力

【技術領域】：本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種高產甘油氧化酶的日本曲霉菌株以及根癌農桿菌介導的日本曲霉轉化方法。

【背景技術】：曲霉屬包括灰綠曲霉(Aspergillus?glaucus)群、白曲霉(Aspergillus?candidus)群、黃曲霉(Aspergillus?flavus)群、雜色曲霉(Aspergillus?versicolor)群、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)群、棕曲霉(Aspergillus?ochraceus)群、構巢曲霉(Aspergillus?nidulans)群、黑曲霉(Aspergillus?niger)群等等。其中黑曲霉群中的很多種，如黑曲霉(Aspergillus?niger)，臭曲霉(Aspergillus?foetidus)，泡盛曲霉(Aspergillus?awamori)等都具有強大的酶系統，目前已經廣泛應用于工業大規模生產各種生物酶制劑，包括淀粉酶、過氧化氫酶、纖維素酶、葡萄糖酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶、脂肪酶、果膠酶、蛋白酶、單寧酶等。黑曲霉群的發酵工藝已經十分成熟。

實際人們對于這些酶還沒有充分利用，所受到的主要限制之一就是，產生的某些酶酶活太低而沒有實用價值。目前，很多研究者已經分別采取物理、化學誘變、原生質體融合以及分子生物學手段來對菌種進行改良，以期得到具有優良產量性狀的菌株。

日本曲霉(Aspergillus?japonicus)屬于半知菌綱，從梗孢目，從梗孢科，曲霉屬的黑曲霉群，分布十分廣泛，可以在棕桐油、空氣、土壤中分離得到。其菌落生長較快，10天直徑就可達5-6厘米，絨狀，紫褐色，反面幼時無色，后變為淡紫褐色。分生孢子頭球形，老后散列成幾個松柱狀結構，分生孢子梗光滑，頂囊球形或稍長，小梗單層，分生孢子球形或近球形，有明顯的小刺。有些菌系產生白色或奶油色的球形菌核，是黑曲霉群中單層小梗的代表類型。

目前發現日本曲霉可以產生甘油氧化酶GLOX，并且日本曲霉產生甘油氧化酶的活力最高，雖然青霉中也可以產生GLOX，但是產生的GLOX結合在菌絲體細胞的表面，難于分離，且很不穩定，不適合生產的需要。所以日本曲霉有作為工程菌株生產甘油氧化酶的潛力，但日本曲霉的基因組序列尚未測通，其中與甘油氧化酶代謝相關的基因目前也還未知，并且甘油氧化酶的產量也相對較低，所以需要建立一套有效的遺傳轉化體系，這樣不僅可以為日本曲霉功能基因的分子生物學研究提供前提，也可以為日本曲霉優良性狀菌株的育種提供手段，同時也為曲霉屬其他的種提供分子生物學研究方法。

根癌農桿菌介導法首先應用于植物的遺傳轉化，并由Bundock首先應用于釀酒酵母的遺傳轉化，之后在絲狀真菌中得到了廣泛的應用，為絲狀真菌的研究奠定了基礎。但目前對于日本曲霉還沒有根癌農桿菌介導的遺傳轉化體系的報道。

【發明內容】：本發明目的在于提供一種高產甘油氧化酶的日本曲霉菌株。本發明的另一目的是克服現有技術存在的上述不足，提供一種根癌農桿菌介導的日本曲霉的轉化方法及甘油氧化酶高產菌株的篩選。

本發明提供的日本曲霉菌株(Aspergillus?japonicus)Ajyz0079，屬于真菌界(Fungi)，子囊菌門(Ascomycota)，半知菌綱(Sphaeropsidales)，從梗孢目(Moniliales)，從梗孢科(Moniliaceae)，曲霉屬(Aspergillus)。其菌落生長較快，10天直徑就可以達到5-6厘米，絨狀，紫褐色，反面幼時無色后變為淡紫褐色。分生孢子頭球形，老后散列成幾個松柱狀結構，分生孢子梗光滑，頂囊球形活稍長，小梗單層，分生孢子球形或近球形，有明顯的小刺。

本發明提供的根癌農桿菌介導的甘油氧化酶高產菌株的轉化及篩選方法，包括以下步驟：

第一、將載體質粒通過三親雜交的方法導入根癌農桿菌，其中所述的載體質粒為pBI-hphII，含有構巢曲霉啟動子PtrpC和相應的終止子TtrpC，在啟動子的下游含有潮霉素B抗性基因；

第二、將上步得到的含有載體質粒的根癌農桿菌和日本曲霉混合培養于含有誘導劑乙酰丁香酮的IM固體培養基上的微孔濾膜上，培養3天后，轉移到含有潮霉素B和頭孢霉素的察氏培養基中30℃培養得到潛在的轉化子；

第三、將第二步得到的潛在的轉化子在不含抗生素的培養基上傳代后，再于含有潮霉素B和頭孢霉素的培養基中培養，得到抗性遺傳穩定的轉化子。

第四、提取第三步得到的轉化子的基因組，以潮霉素B抗性基因的特異性引物檢測轉化子的陽性，并以該抗性基因作為探針檢測抗性基因的插入拷貝數。