[發(fā)明專利]乙型肝炎病毒體外感染模型的構(gòu)建方法及應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910070982.0
• 申請日: 2009-10-27
• 公開（公告）號: CN101696396A
• 公開（公告）日: 2010-04-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 金敏;郭向飛;李君文;陳照立;邱志剛;諶志強;王新為;王景峰
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究所
• 主分類號: C12N5/0735
• 分類號: C12N5/0735;C12Q1/70;C12R1/93
• 代理公司: 天津市三利專利商標代理有限公司 12107
• 代理人: 劉莎莉

1.一種乙型肝炎病毒體外感染模型的構(gòu)建方法，它包括人胎肝干細胞的分離培養(yǎng)、鑒定人胎肝干細胞、乙肝病毒血清感染人胎肝干細胞和驗證乙肝病毒已感染細胞且病毒已繁殖，其特征在于：本發(fā)明采用人胎肝干細胞用于抗乙型肝炎病毒藥物篩選的乙型肝炎病毒體外感染模型的構(gòu)建方法的步驟為分離培養(yǎng)人胎肝干細胞、免疫組化鑒定人胎肝干細胞、乙肝病毒血清感染人胎肝干細胞、驗證乙肝病毒已感染人胎肝干細胞且病毒已繁殖：

I.分離培養(yǎng)人胎肝干細胞：

(1).人胎肝干細胞的分離培養(yǎng)：將膠原酶原位灌注肝臟-剝離肝細胞懸液-過濾-充分散開細胞-離心細胞懸液-棄掉上清液-沉淀的細胞用培養(yǎng)基懸浮-將細胞放入離心管中-置于冰上沉淀-利用肝干細胞黏附作用使細胞沉淀-去除細胞懸液-離心沉淀細胞-細胞用PBS液懸浮-用PBS液將Percoll按體積分數(shù)配成30％-90％的濃度梯度-離心并吸取位于不同Percoll之間細胞層懸浮沉淀的細胞-接種于塑料培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基為含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液-并在37℃、5％CO₂孵箱中培養(yǎng)過夜，新分離的細胞用0.25％臺盼藍染色觀察細胞活力；

(2).人胎肝干細胞的培養(yǎng)與傳代：細胞接種18h后首次更換培養(yǎng)液，棄去未貼壁細胞，以后每3-5天換液1次。兩周后細胞數(shù)量成對數(shù)生長，形成小細胞克隆，四周后，小克隆逐漸增多，鋪滿瓶底。質(zhì)量分數(shù)0.25％胰蛋白酶消化細胞，按1∶2比例傳代。

II.免疫組化鑒定人胎肝干細胞：采用SP免疫組化試劑盒檢測AFP、OV-6、CK19、CD34、CK18表面標志，以PBS代替各表面標志的一抗作為陰性對照，步驟如下：消化細胞后低速離心，PBS懸起細胞-接種于蓋玻片上-通風晾干-PBS充分洗滌-抗原熱修復-PBS洗滌多次后呈紅棕色染色為陽性-蘇木素復染；

III.乙肝病毒血清感染人胎肝干細胞：將HBV(10⁷-10⁸Copies)血清接種到無血清培養(yǎng)液的六孔板胎肝干細胞中；孵育后，吸取上清液，采用培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，每隔48h取上清即可獲得HBV。

IV.采用以下三種方法驗證乙肝病毒已感染人胎肝干細胞且繁殖：

(1).熒光定量PCR檢測不同時間細胞上清的病毒滴度；

(2).ELISA檢測不同時間細胞上清中病毒HBsAg分泌情況：采用乙肝病毒s抗原檢測試劑盒對不同時間細胞上清進行HBsAg的檢測；

(3).原位雜交檢測細胞內(nèi)病毒：將感染病毒的細胞，于病毒洗去后第三天和第七天進行生物素(POD)和熒光探針標記原位雜交。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒體外感染模型的構(gòu)建方法，其特征在于：所述的人胎肝干細胞是與肝臟胚胎發(fā)育及再生有關(guān)的各類具有干細胞特性的細胞，是卵圓細胞或成肝細胞或兼性肝細胞或小肝細胞或肝側(cè)群細胞或肝前體細胞。

3.一種乙型肝炎病毒體外感染模型的應(yīng)用，其特征在于：所述的采用人胎肝干細胞用于體外抗乙型肝炎病毒藥物的篩選與效果評價，即將穩(wěn)定生長的人胎肝干細胞接種六孔板中24h后，將其與病毒血清孵育24h，吸去病毒液，PBS洗6遍，留洗后液待檢；分別加入200IU/ml、500IU/ml、1000IU/ml、2000IU/ml的抗乙型肝炎病毒藥物，另外，以不加抗乙型肝炎病毒藥物組作為陽性對照，以不加病毒及抗乙型肝炎病毒藥物組作為陰性對照，每組重復三孔，37℃孵育，3天后取上清，熒光定量PCR和電泳檢測乙肝病毒的繁殖抑制情況。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的乙型肝炎病毒體外感染模型的應(yīng)用，其特征在于：所述的用于體外抗乙型肝炎病毒藥物是化學藥物或中草藥或生物工程藥或干擾素。