[發(fā)明專利]S100A4蛋白的純化與鑒定

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910070460.0
• 申請(qǐng)日: 2009-09-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102020708A
• 公開(kāi)（公告）日: 2011-04-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王天輝;劉洪濤;徐傳香;劉子泉;陳學(xué)偉;崔博;佘曉俊;張娜;馬強(qiáng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所
• 主分類號(hào): C07K14/435
• 分類號(hào): C07K14/435;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/22;G01N27/447;G01N33/548
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.權(quán)利要求1所述的S100A4蛋白的純化與鑒定，其特征在于包括如下步驟：

(1)S100A4蛋白的純化

①將金屬鰲合層析柱(GE?Health)連接AKTA?FPLC蛋白純化儀，并以約5倍體積的結(jié)合緩沖液平衡至基線。

②平衡以后，將破碎上清以結(jié)合緩沖液稀釋3-5倍以0.45μm的除菌濾器過(guò)濾除菌后以3mL/min的流速上樣，收集穿透液。

③以結(jié)合緩沖液平衡至基線，用洗脫緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，以3mL/管收集A280峰，進(jìn)行SDS-PAGE鑒定和純度鑒定。

(2)S100A4蛋白的脫鹽

采用GE?Health?HiTrap?Desalting柱進(jìn)行脫鹽處理，程序參照該層析柱說(shuō)明書，簡(jiǎn)言之，緩沖液為生理鹽水緩沖液，平衡柱子3-5個(gè)柱床體積后，用注射器手推上樣，上樣過(guò)程中棄去所有的流出液，上樣完畢后，將層析柱連接FPLC系統(tǒng)，監(jiān)測(cè)A280值與電導(dǎo)，進(jìn)行SDS-PAGE分析

(3)蛋白鑒定

a?SDS-PAGE鑒定

①將上一步驟中收集的破碎后上清液吸取25μl，再加入25μl的2×SDS上樣緩沖液，混勻；

②取破碎后的沉淀少許，加入25μl的PBS重懸后，再加入25μl的2×SDS上樣緩沖液，混勻；

③將上述兩者100℃煮沸5min，并短暫離心，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，鑒定其表達(dá)形式。b?Western-Blot鑒定

按照常規(guī)Western-Blot法操作規(guī)程操作，以兔抗S100A4(來(lái)源：Santa?clouse公司)為抗，進(jìn)行鑒定所表達(dá)的S100A4蛋白。