[發明專利]S100A4蛋白的純化與鑒定無效
| 申請號： | 200910070460.0 | 申請日： | 2009-09-17 |
| 公開（公告）號： | CN102020708A | 公開（公告）日： | 2011-04-20 |
| 發明（設計）人： | 王天輝;劉洪濤;徐傳香;劉子泉;陳學偉;崔博;佘曉俊;張娜;馬強 | 申請（專利權）人： | 中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所 |
| 主分類號： | C07K14/435 | 分類號： | C07K14/435;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/22;G01N27/447;G01N33/548 |
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| 地址： | 300050*** | 國省代碼： | 天津;12 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | s100a4 蛋白 純化 鑒定 | ||
1.權利要求1所述的S100A4蛋白的純化與鑒定，其特征在于包括如下步驟：
(1)S100A4蛋白的純化
①將金屬鰲合層析柱(GE?Health)連接AKTA?FPLC蛋白純化儀，并以約5倍體積的結合緩沖液平衡至基線。
②平衡以后，將破碎上清以結合緩沖液稀釋3-5倍以0.45μm的除菌濾器過濾除菌后以3mL/min的流速上樣，收集穿透液。
③以結合緩沖液平衡至基線，用洗脫緩沖液進行線性梯度洗脫，以3mL/管收集A280峰，進行SDS-PAGE鑒定和純度鑒定。
(2)S100A4蛋白的脫鹽
采用GE?Health?HiTrap?Desalting柱進行脫鹽處理，程序參照該層析柱說明書，簡言之，緩沖液為生理鹽水緩沖液，平衡柱子3-5個柱床體積后，用注射器手推上樣，上樣過程中棄去所有的流出液，上樣完畢后，將層析柱連接FPLC系統，監測A280值與電導，進行SDS-PAGE分析
(3)蛋白鑒定
a?SDS-PAGE鑒定
①將上一步驟中收集的破碎后上清液吸取25μl，再加入25μl的2×SDS上樣緩沖液，混勻；
②取破碎后的沉淀少許，加入25μl的PBS重懸后，再加入25μl的2×SDS上樣緩沖液，混勻；
③將上述兩者100℃煮沸5min，并短暫離心，進行SDS-PAGE電泳，鑒定其表達形式。b?Western-Blot鑒定
按照常規Western-Blot法操作規程操作，以兔抗S100A4(來源：Santa?clouse公司)為抗，進行鑒定所表達的S100A4蛋白。
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