[發明專利]溫度敏感聚乙烯亞胺-接枝-聚丙烯酸寡乙二醇酯嵌段共聚物及制備方法和應用

無效

• 申請號: 200910069310.8
• 申請日: 2009-06-18
• 公開（公告）號: CN101585921A
• 公開（公告）日: 2009-11-25
• 發明（設計）人: 劉文廣;楊建海;張鵬
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C08G81/02
• 分類號: C08G81/02;C12N15/63
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司
• 代理人: 王小靜

技術領域

本發明涉及溫度敏感性轉基因載體的制備，特別是一種聚乙烯亞胺-接枝-聚丙烯酸乙酯嵌段共聚物及制備方法和應用，具體是聚乙烯亞胺-接枝-聚2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯/甲基丙烯酸-β-羥乙酯[PEI-g-(MeO2MA-b-HEMA)]嵌段共聚物及制備方法和應用。

背景技術

基因治療是指將人的正常基因或有治療作用的基因通過一定方式導入人體靶細胞以糾正基因的缺陷或者發揮治療作用。應用于基因治療的載體主要有病毒載體(viral?vector)和非病毒載體(nonviral?vector)兩種。可采用的病毒載體有逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒(AAV)等。非病毒載體包括裸DNA、脂質體、陽離子高聚物等。

陽離子高聚物作為非病毒載體的一部分，它既存在非病毒載體的特點(即低毒性，低免疫原性和低致癌性)以外，還有自身的優勢，易制備和攜帶目的基因能力高，有利于其作為轉基因載體的應用。但基因轉染效率遠低于病毒載體。常見的陽離子高聚物能夠通過強靜電作用有效縮合DNA，形成的聚電解質復合物(PECs)較穩定。這些PECs易于細胞內化，從內涵體中逃逸，并能保護DNA免受DNA酶的降解。但是，強烈的靜電作用也限制了基因進入細胞核之后從復合物中的釋放，限制了基因的表達。針對陽離子聚合物載體與pDNA復合物解包裹成為最終基因轉染的障礙，現在主要是提高其轉染的可控制性，進而提高其轉染效率。

智能高分子載體的自適應特性能有效解決常規載體對于DNA“易包裝、難拆解”的難題，具有很好的應用前景。其中溫度敏感性載體以其設計方便，調解靈活的特點受到了極大的關注，被廣泛用于藥物、基因控制釋放領域。

對于溫度響應性聚合物來說，其低臨界溶解溫度以下溶于水，高分子鏈段呈無規線團狀；溫度高于LCST時，高分子鏈段從水中析出，鏈段呈密實的小球。溫度敏感組分與壓縮DNA組分結合既保持溫度響應性，又具有復合DNA的功能，因而，通過改變溫度，利用溫度敏感組分的相變可實現對DNA結合和解離的調控。

近年來，一些以聚異丙基丙烯酰胺為溫度敏感組分的轉基因載體被研制成功，并得到了很好的轉染結果。Hinrichs等首次將異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)與N，N’-(二甲基胺乙基)甲基丙烯酸酯(DMAEMA)的共聚物作為溫度和pH值響應的轉基因載體，其中NIPAAm提供溫度響應性，DMAEMA存在氨基，可提供一定的正電荷密度，可與DNA的靜電相互作用形成復合物。增加共聚物中NIPAAm的含量，復合物的細胞毒性明顯降低，這說明NIPAAm對于DMAEMA的細胞毒性有明顯的屏蔽效應。他們的結果顯示高分子量的共聚物對卵巢癌細胞的轉染效果較好，但未能得出聚合物的LCST和轉染之間的相關性Yokoyama等將疏水單元甲基丙烯酸丁酯(BMA)引入到PNIPAAm-co-DMAEMA體系形成三元共聚物，來調節相變溫度。體外轉染實驗研究發現溫度變化不會影響不含NIPAAm的共聚物，而三元共聚物的變溫培養的轉染效率比恒溫培養的轉染效率高，另外還發現在更高的溫度(37℃和45℃)進行復合得到的復合物比在室溫條件下得到的復合物的轉染效率更高。劉文廣等通過化學合成方法合成兩親性殼聚糖-接枝-異丙基丙烯酰胺/月桂酸乙烯酯(PNVLCS)共聚物，并考察PNVLCS共聚物的溫度敏感性。研究發現溫度變化可引起共聚物載體的相轉變，并影響到與DNA的結合程度。PNVLCS成功地將pTracerTM-CMV/Bsd/lacZ?Vector質粒轉入C2C12細胞內，溫度敏感PNVLCS共聚物載體的轉染效率可由溫度控制進一步提高。最近，劉文廣等又通過自由基聚合反應和偶聯反應制備了聚異丙基丙烯酰胺/聚精氨酸綴合物(PNIPArg)，通過FTIR和¹³C?NMR實驗證實了偶聯產物。由濁度法測定了綴合物水溶液的LCST為35.2℃。PNIPArg綴合物與質粒DNA通過靜電作用形成復合物，呈現均一球狀形態。以綠猴腎細胞COS-1為宿主細胞，考察了PNIPArg載體對含有可表達熒光素酶(luciferase)和綠色熒光蛋白(GFP)的質粒PGL3和pEGFP-C1體外轉染效率，其轉染效率明顯高于裸DNA，同脂質體相當。同時可以通過改變溫度調控基因的表達效率，NIPAAm的引入顯著降低了載體的細胞毒性。