[發(fā)明專利]一種D-泛解酸內(nèi)酯水解酶固定化方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910068667.4
• 申請日: 2009-04-29
• 公開（公告）號: CN101538564A
• 公開（公告）日: 2009-09-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 寧新利;別松濤;李麗鳳;杜連祥
• 申請（專利權(quán)）人: 河北寶利藥業(yè)有限公司;天津科技大學(xué)
• 主分類號: C12N11/06
• 分類號: C12N11/06
• 代理公司: 天津盛理知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 王來佳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于酶固定化領(lǐng)域，尤其是一種D-泛解酸內(nèi)酯水解酶固定化方法。

背景技術(shù)

泛酸是B族維生素，輔酶A的組成部分，其生理功能有：參與體內(nèi)脂肪酸降解、脂肪酸合成、檸檬酸循環(huán)、膽堿乙酰化、抗體的合成等，因此D-泛酸廣泛用于醫(yī)藥、食品、飼料工業(yè)，其活性成分為D-構(gòu)型的右旋泛酸(V_B3)。但因泛酸不穩(wěn)定，其商品形式主要為D-泛酸鈣、D-泛酸鈉、鉀等。生產(chǎn)D-泛酸的主要技術(shù)是中間體DL-泛解酸內(nèi)酯的手性拆分技術(shù)，合成路線是通過拆分DL-泛解酸內(nèi)酯制備中間體(D-泛解酸或D-泛解酸內(nèi)酯)，再由D-泛解酸或D-泛解酸內(nèi)酯與β-氨基丙酸反應(yīng)得到D-泛酸。

目前，D-泛解酸內(nèi)酯在工業(yè)上一般采用液體深層發(fā)酵法獲得菌絲體作酶源，該酶源即為D-泛解酸內(nèi)酯的水解酶，采用該水解酶水解DL-泛解酸內(nèi)酯中的D-泛解酸內(nèi)酯，分離得到D-泛解酸，再經(jīng)內(nèi)酯化反應(yīng)，得到光學(xué)純度很高的D-泛解酸內(nèi)酯。但這一工藝存在發(fā)酵周期長、酶液利用率低、產(chǎn)物后處理工藝多等缺點。例如，因為產(chǎn)生副反應(yīng)和所需生化產(chǎn)物的進(jìn)一步代謝使完整細(xì)胞生產(chǎn)的產(chǎn)物純度可能比使用固定化酶低；另外，細(xì)胞使用相當(dāng)長的時間后，常常會發(fā)生自溶，尤其是在細(xì)胞有可能進(jìn)行增殖時，細(xì)胞的漏出就特別明顯；再者，單位體積反應(yīng)器內(nèi)菌絲的活性較低，反應(yīng)器的利用率小。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種D-泛解酸內(nèi)酯水解酶固定化方法，本方法有效解決了D-泛解酸內(nèi)酯在工業(yè)生產(chǎn)過程中存在的工藝問題，提高了D-泛解酸內(nèi)酯的生產(chǎn)效能，降低了D-泛解酸內(nèi)酯的生產(chǎn)成本。

本發(fā)明實現(xiàn)目的的技術(shù)方案是：

一種D-泛解酸內(nèi)酯水解酶固定化方法，步驟是：

(1)利用膠體磨預(yù)處理菌絲體后，再利用高壓均質(zhì)機在壓力為0.5～1.5MPa、溫度為0～5℃的條件下進(jìn)行均質(zhì)，均質(zhì)后的細(xì)胞破碎液在轉(zhuǎn)速為4000～8000r/min下離心10～30分鐘，取上清液，該上清液即為D-泛解酸內(nèi)酯水解酶液；

(2)取處理好的大孔離子交換樹脂用pH為7.0的磷酸緩沖液重懸，加入戊二醛溶液至終濃度為0.1～0.3％，輕輕振動1～5個小時，然后用去離子水將多余的戊二醛洗掉；

(3)按1∶5～1∶10質(zhì)量比將交聯(lián)后的大孔離子交換樹脂懸浮于濃度介于12～50U/ml?D-泛解酸內(nèi)酯水解酶液中，0～16℃固定5～15小時，用去離子水洗滌以除去游離酶，即得到固定化的D-泛解酸內(nèi)酯水解酶。

而且，所述大孔離子交換樹脂采用D201GF，其處理方法是：取大孔離子交換樹脂D201GF，首先用去離子水清洗3次，接著用4％NaOH浸泡4h后去離子水清洗至中性，在用4％HCl浸泡4h后轉(zhuǎn)為Cl型，然后用去離子水清洗至中性，最后用2倍體積以上去離子水浸泡備用。

本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是：

1、本發(fā)明通過高壓均質(zhì)機機械破壁的方法獲取高質(zhì)量的D-泛解酸內(nèi)酯水解酶酶液，以大孔離子交換樹脂D201GF為載體，以戊二醛為交聯(lián)劑，經(jīng)兩步反應(yīng)，固定D-泛解酸內(nèi)酯水解酶，不但進(jìn)一步提高了D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的負(fù)載量，而且大幅度降低了固定化D-泛解酸內(nèi)酯水解酶在使用過程中酶活的損失。

2、本發(fā)明克服了細(xì)胞使用相當(dāng)長的時間后所發(fā)生的自溶，以及單位體積反應(yīng)器內(nèi)菌絲的活性較低、反應(yīng)器的利用率小等缺陷，具有很好的操作穩(wěn)定性，能反復(fù)使用，利用率高，可實現(xiàn)生產(chǎn)工藝連續(xù)化、自動化，因此應(yīng)用前景十分廣闊。

3、本發(fā)明以大孔離子交換樹脂D201GF為載體，通過與戊二醛兩步反應(yīng)，固定了D-泛解酸內(nèi)酯水解酶，克服了傳統(tǒng)菌絲直接反應(yīng)法的不足，該固定化酶顆粒形狀均一，機械強度好，表面積大，大幅度提高了酶負(fù)載量，增強了酶活，酶活力回收率平均達(dá)到了85％，固定化酶循環(huán)使用次數(shù)達(dá)到50次以上，降低了游離酶的反應(yīng)成本，且工藝簡單，生產(chǎn)設(shè)備投資少。

具體實施方式

以下將本發(fā)明的內(nèi)容通過下列的較優(yōu)的實施例作進(jìn)一步的闡述，但這些實施例并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實施例1：

一種D-泛解酸內(nèi)酯水解酶固定化方法，步驟是：

(1)取發(fā)酵菌絲體50Kg，在三足離心機內(nèi)，用自來水沖洗三次以去除培養(yǎng)基中的色素等雜物；按照菌絲體重量比1∶4的比例，加入pH為7.0、0.02M磷酸緩沖液，采用膠體磨處理菌絲體，充分混勻；將研磨后的菌絲體漿利用高壓均質(zhì)機在壓力0.5MPa、溫度為0℃的條件下進(jìn)行均質(zhì)；將細(xì)胞破碎液在轉(zhuǎn)速為4000r/min下，離心10分鐘，取上清液，該上清液即為D-泛解酸內(nèi)酯水解酶液，測酶活及體積。