[發明專利]堿性果膠酶基因工程菌及其構建方法

有效

• 申請號: 200910068617.6
• 申請日: 2009-04-24
• 公開（公告）號: CN101531988A
• 公開（公告）日: 2009-09-16
• 發明（設計）人: 路福平;肖靜;王春霞;郝育杰
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/75;C12R1/125
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司
• 代理人: 王來佳

技術領域

本發明屬于生物工程領域，尤其涉及一種堿性果膠酶基因工程菌及其構建方法。

背景技術

果膠酶(pectinase)是一類分解果膠質的酶的總稱，是含有多種組分的復合酶。果膠酶廣 泛分布于高等植物和微生物中，但從植物中提取受到資源、技術水平的諸多限制而一直未能真 正實現產業化，因此微生物來源的果膠酶成為研究熱點。國內外對酸性果膠酶的研究已經具有 一定基礎，但是對堿性果膠酶尤其是果膠裂解酶(pectate?lyase)的研究報道較少。

堿性果膠酶是指最適作用pH在堿性范圍內的果膠酶，是果膠酶研究領域中的新興內容，主 要應用于紡織工業中用作對環境友好的生物催化劑，用柔和的酶生物精練代替傳統的堿高溫蒸 煮技術，實現綠色清潔生產，既可減少堿排放污染，又可降低加熱能耗和漂洗用水量，同時提 高紡織物的加工和使用性能。因而隨著生物技術的不斷快速發展，堿性果膠酶在紡織工業中的 應用潛力也越來越受到大家的關注。

從1972年Horikoshi，K.發表第一篇關于芽孢桿菌生產堿性果膠酶的論文開始，日本等國 開始致力于堿性果膠酶的研究。印度Mukesh?Kapoor于2001年報道了Bacillus?sp.MG-cp-2 堿性聚半乳糖醛酸酶的生產、純化和酶學性質，確定該菌株發酵活力為47u/mL，培養基優化后 活力提升為98u/mL，室溫時在pH7.0～12.0范圍內穩定，可有效應用于苧麻和菽麻纖維脫膠； 德國學者2004年測定了果膠酶菌種Bacillus?licheniformis?DSM13的基因組序列。美國、荷 蘭、英國、西班牙等國的學者也分別對堿性果膠酶的菌種資源、發酵、純化方法、酶學性質、 分泌調控及分子生物學等內容進行了報道，研究對象除了上述芽孢桿菌之外，還包括一些植物 病原菌，如菊歐文氏菌、洋蔥伯克霍爾德菌等。

為了獲得高產，優質的堿性果膠酶產品，自1990年以來，國外學者把研究重點從篩選產堿 性果膠酶菌種方面逐步轉向產酶基因及基因工程菌的研究上，尤其是隨著1999年丹麥Novo Nordisk(諾和諾德)堿性果膠酶Bioprep(是一種基因改良的芽孢桿菌經發酵制成的酶制劑， 其最適pH值為7.5～9.5，適用溫度為55℃左右)和堿性果膠裂解酶ScourzymeL(最佳pH值 為7.5～9.5，對溫度的選用則根據pH值而定，如pH值在8～8.5時，溫度掌握在55℃～60℃) 的產品問世，人們將注意力越來越多地轉向了酶基因及其克隆技術的研究。西班牙、法國、荷 蘭、日本學者分別將Bacillus?sp.(2000年)、Erwinia?chrysanthemi3937、Thermotoga?maritima (海棲熱袍菌，2003年)、Bacillus?subtilis(2002年)四種菌株的堿性果膠酶基因克隆到 大腸桿菌中成功進行了表達。

國內對果膠酶的研究始于20世紀60年代，1990年初開始對堿性果膠酶進行研究，大量文 獻對果膠酶菌種的篩選、傳統誘變育種、生產工藝和酶的工業應用等方面做了報道，但關于堿 性果膠酶的發酵、酶制劑制備和分子生物學遺傳育種方面的研究內容較少。菌種主要是芽孢桿 菌，如吉氏芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌No.46、XZ2、B13、LH-16、WSHB04-02 以及小芽孢桿菌WSH03-09、RK9等，此外還有嗜鹽嗜堿菌Alkalibacterium?sp.F26等。2006 年我國學者甄東曉等將Clostridium?stercorarium(耐熱梭狀芽孢桿菌)的耐熱果膠裂解酶基 因pel9A克隆到表達載體pET28α然后轉化大腸桿菌進行表達；同年，諸葛斌等利用溫控載體 構建了堿性果膠酶工程菌。越來越多的研究單位在基因工程菌應用于工業生產的總體趨勢下進 行了堿性果膠酶分子生物學操作的有效嘗試，大多分子生物學操作或以大腸桿菌表達體系為主 要內容，或以枯草芽孢桿菌表達體系為研究對象，但大多載體和宿主的選擇在以生產為目的時 均顯示了某種不足，例如溫控載體和穿梭質粒的使用會因表達中需要溫度、誘導劑等條件而增 加生產成本。

我國堿性果膠酶研究總體起步較晚，在國外酶制劑公司80％的工業用酶都是由基因工程菌 發酵生產獲得，發酵酶活較高、酶學性質優良的酶制劑工業生產背景下，必須進行基因工程菌 構建體系和方法的研究以拓寬民族工業酶制劑的競爭和發展空間。

發明內容

本發明的目的在于提供一種堿性果膠酶的基因工程菌及其構建方法，以獲得高產堿性果膠 酶基因工程菌。