[發(fā)明專(zhuān)利]包括人類(lèi)組織因子途徑抑制因子的重組質(zhì)粒及高表達(dá)人類(lèi)組織因子途徑抑制因子重組酵母菌

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910068252.7
• 申請(qǐng)日: 2009-03-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101509010A
• 公開(kāi)（公告）日: 2009-08-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 冷希崗;徐偉杰;朱筠;董霞;宋麗萍
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/63
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/63;C12N15/66;C12N1/19;C12N15/81;C12R1/84
• 代理公司: 天津市北洋有限責(zé)任專(zhuān)利代理事務(wù)所
• 代理人: 陸 藝

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及包括人類(lèi)組織因子途徑抑制因子的重組質(zhì)粒及高表達(dá)人類(lèi)組織因子途徑抑制因子重組酵母菌。

技術(shù)背景

在多種疾病進(jìn)程中，包括癌癥、心腦血管疾病和炎癥等，由組織因子(tissue?factor，TF)引發(fā)的外源性凝血系統(tǒng)的激活扮演重要角色，一些患者因此致死。組織因子途徑抑制因子(tissue?factor?pathway?inhibitor，TFPI)是抑制外源凝血的一種重要蛋白因子。大量臨床實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，重組人組織因子途徑抑制因子(human?recombinant?tissue?factorpathway?inhibitor，rhTFPI)對(duì)血栓形成、感染性休克、血管再狹窄、內(nèi)毒素血癥和DIC等具有明顯防治作用，在臨床上有廣泛的應(yīng)用前景。目前，重組人TFPI制備的效果很不理想，存在的主要問(wèn)題是表達(dá)量較低，以哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)為例，表達(dá)量最高(約2-5mg/L)，但成本也最高。因此，通過(guò)分子生物技術(shù)上的改造，得到能夠高表達(dá)人類(lèi)組織因子途徑抑制因子的重組酵母菌，將有效降低重組人組織因子途徑抑制因子的生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種包括人類(lèi)組織因子途徑抑制因子的重組質(zhì)粒。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種高表達(dá)人類(lèi)組織因子途徑抑制因子重組酵母菌。

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：

包括人類(lèi)組織因子途徑抑制因子的重組質(zhì)粒，用下述方法制成：以序列表SEQ?IDNo.2、SEQ?ID?No.3所述核苷酸序列為PCR引物，以重組質(zhì)粒mTFPI-pPIC9為模板，擴(kuò)增出人類(lèi)組織因子途徑抑制因子基因閱讀框架，回收得到序列表SEQ?ID?No.1所述的1125bp的核苷酸序列，與pPIC9K加入T4連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，制備成包括人類(lèi)組織因子途徑抑制因子的重組質(zhì)粒rhTFPI-pPIC9K。

高表達(dá)人類(lèi)組織因子途徑抑制因子重組酵母菌，用下述方法制成：將包括人類(lèi)組織因子途徑抑制因子的重組質(zhì)粒rhTFPI-pPIC9K導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母工程菌種GS115，獲得基因組中包含序列表SEQ?ID?No.4所述的人類(lèi)組織因子途徑抑制因子基因的重組酵母菌，運(yùn)用抗生素G418抗性篩選，獲得高表達(dá)人類(lèi)組織因子途徑抑制因子重組酵母菌GS115-rhTFPI-pPIC9K?anti-G418。

本發(fā)明應(yīng)用劑量效應(yīng)的原理，運(yùn)用抗生素G418抗性，篩選出高表達(dá)人類(lèi)組織因子途徑抑制因子重組酵母菌。經(jīng)過(guò)高密度發(fā)酵，使菌種表達(dá)人類(lèi)組織因子途徑抑制因子的量大大提高，達(dá)到每升培養(yǎng)基6.8mg左右。

(G418即G-418?sulfate，也稱(chēng)Geneticin，遺傳霉素，分子式為C20H40N4O10.2H2SO4，分子量為692.71g/mole)

附圖說(shuō)明

圖1為PCR擴(kuò)增TFPI：片段大小為：1,125bp；

圖2為質(zhì)粒rhTFPI-pPIC9K限制性?xún)?nèi)切酶EcoR?I，Xho?I，Bgl?II，Hind?III酶切電泳圖；

圖3為Western?Blot檢測(cè)結(jié)果；

圖4為不同rhTFPI基因拷貝數(shù)酵母rhTFPI表達(dá)量對(duì)照；

圖5為高表達(dá)人類(lèi)組織因子途徑抑制因子重組酵母菌發(fā)酵罐高密度培養(yǎng)rhTFPI表達(dá)量。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。

實(shí)施例1??制備包括人類(lèi)組織因子途徑抑制因子的重組質(zhì)粒

1.分別設(shè)計(jì)上、下游PCR引物，以序列表SEQ?ID?No.2、SEQ?ID?No.3所示，由上海生工負(fù)責(zé)合成并純化。以重組質(zhì)粒mTFPI-pPIC9為模板(專(zhuān)利號(hào)：ZL200610015651.3)，擴(kuò)增出人類(lèi)組織因子途徑抑制因子基因閱讀框架，

反應(yīng)體系為??????????????????????100μL

1)TaKaRa?Ex?Taq(5U/μL)??????????0.5μL????????????反應(yīng)條件為：

2)10×ExTaqBuffer(Mg²⁺Plus)?????10μL?????????????94℃?30sec

3)dNTP?Mixture(各2.5mM)?????????4μL??????????????55℃?30sec

4)模板DNA???????????????????????20ng?????????????72℃?1min