[發(fā)明專利]重組β-內(nèi)酰胺酶與RGD融合蛋白及其在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910068038.1
• 申請日: 2009-03-06
• 公開（公告）號: CN101824406A
• 公開（公告）日: 2010-09-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周曉靚;呂茜茜;王浩;施培基;王榮先
• 申請（專利權(quán)）人: 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所
• 主分類號: C12N9/96
• 分類號: C12N9/96;C12N15/70;C12P21/02;A61K38/50;A61P35/00;A61P15/14;C12R1/19
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于抗體導(dǎo)向酶-前藥療法(ADEPT)技術(shù)領(lǐng)域，更具體的說是 一種重組β-內(nèi)酰胺酶與RGD融合蛋白及其在治療乳腺癌中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

高選擇性腫瘤化療是目前腫瘤研究的重要課題之一，大多數(shù)化療藥物 缺乏對腫瘤組織的高選擇性，往往在對腫瘤組織發(fā)揮作用的同時(shí)也對身體 的正常組織產(chǎn)生毒副作用。單克隆抗體技術(shù)問世以來，為腫瘤的導(dǎo)向治療 提供了基礎(chǔ)。前藥是一類本身無活性或活性很低，但在體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為活性 物質(zhì)的藥物。利用抗體做為載體攜帶前藥的專一性活化酶，可以選擇性地 結(jié)合于腫瘤部位，使前藥可以區(qū)域特異性在腫瘤組織內(nèi)轉(zhuǎn)化為活性細(xì)胞毒 分子，這種方法被稱為“抗體導(dǎo)向酶-前藥療法(antibody-directed enzyme?prodrug?therapy，ADEPT)。自1987年Bagshawe提出ADEPT這 一概念，已引起了人們的廣泛的關(guān)注，他克服了以往化學(xué)免疫偶聯(lián)物和免 疫毒素存在的許多問題。Bagshawe從綠膿桿菌中分離羧肽酶G2并且克隆 入人大腸桿菌中，最初是用來降解甲氨蝶呤，后來用來切除苯甲酸氮芥的 衍生物上谷氨酸部分使之活化。這是目前最具代表性的一套ADEPT系統(tǒng)， 而且已進(jìn)入小規(guī)模臨床試驗(yàn)階段。只需要少量的酶-抗體交聯(lián)物就可以在 腫瘤部位催化大量的前體藥物變?yōu)橛卸拘宰饔玫幕钚运幬?。ADEPT方案的 優(yōu)勢在于一個(gè)酶分子可以轉(zhuǎn)化很多個(gè)分子的前體藥物，在腫瘤部位產(chǎn)生高 濃度的活性藥物，這樣可以彌補(bǔ)臨床應(yīng)用中免疫聯(lián)物結(jié)合力較低的缺點(diǎn)， 另有證據(jù)表明，在腫瘤表面產(chǎn)生高濃度藥物比全身應(yīng)用同等濃度的活性藥 物更加有效。

β-內(nèi)酰胺酶是由抗生素處理過的耐藥菌株產(chǎn)生的一類外源性酶。內(nèi) 酰胺類的藥物用于治療細(xì)菌感染已經(jīng)在臨床上使用很多年了。β-內(nèi)酰胺 類化合物對人體的毒性很低，而且不會(huì)被人體內(nèi)源性的酶水解。而且，β -內(nèi)酰胺酶是一個(gè)單鏈的蛋白，分子量相對較小，性質(zhì)穩(wěn)定且易于純化。 一種β-內(nèi)酰胺酶的突變體具有更好的免疫學(xué)性質(zhì)，更適用于ADEPT。將β -內(nèi)酰胺酶融合到一段單鏈抗體后，能夠富集于腫瘤部位，在血漿很快的 清除。β-內(nèi)酰胺酶可以激活一系列化療藥的前藥，而且，作為一種可溶 性蛋白，β-內(nèi)酰胺酶可以在大腸桿菌中量產(chǎn)，便于今后臨床使用。

細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)或細(xì)胞培養(yǎng)的支架材料等的粘附是細(xì)胞生存與增 殖所必需的，這種粘附主要通過一種被稱為整合素的物質(zhì)來介導(dǎo)。癌細(xì)胞 表面的整合素與正常組織粘連，造成癌轉(zhuǎn)移。整合素分子最重要的識別序 列是蛋白質(zhì)中的Arg-Gly-Asp(精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸，簡稱RGD) 序列，大多數(shù)整合素都可識別它。所以如果ADEPT中的β-內(nèi)酰胺酶與RGD 序列進(jìn)行融合表達(dá)，它就可以特異性的將β-內(nèi)酰胺酶定位于癌細(xì)胞表面， 特異性的在癌細(xì)胞表面對前藥進(jìn)行活化，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的一個(gè)目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種具有細(xì)胞粘 附活性的β-內(nèi)酰胺酶-RGD融合蛋白及其編碼的多核苷酸。特別是具有 RGD4C：Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly的β-內(nèi)酰胺酶 -RGD4C融合蛋白。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供β-內(nèi)酰胺酶-RGD融合蛋白在乳腺癌藥 物治療中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的β-內(nèi)酰胺酶-RGD融合蛋白，它的氨基酸序列包含了 源于β-內(nèi)酰胺酶的序列以及含短肽RGD的序列。為此，本發(fā)明提供了如 下的技術(shù)方案：

一種β-內(nèi)酰胺酶-RGD融合蛋白，其所具有的氨基酸序列如下：