[發明專利]一種兩親性高分子陽離子聚合物的應用

有效

• 申請號: 200910067480.2
• 申請日: 2009-09-02
• 公開（公告）號: CN101638668A
• 公開（公告）日: 2010-02-03
• 發明（設計）人: 田華雨;陳學思;陳杰;郭兆培;林琳;陳磊;夏加亮;景遐斌
• 申請（專利權）人: 中國科學院長春應用化學研究所
• 主分類號: C12N15/87
• 分類號: C12N15/87
• 代理公司: 長春科宇專利代理有限責任公司
• 代理人: 馬守忠

技術領域

本發明屬生物技術領域，涉及一種兩親性高分子陽離子聚合物作為siRNA轉染載體及用法。

背景技術

RNA干擾現象是利用siRNA靶向實現轉錄后水平基因沉默的現象，RNAi是通過siRNA介導的特異性高效抑制基因表達途徑，由siRNA介導識別并靶向切割同源性靶mRNA。siRNA基因沉默技術是治療各種基因相關疾病的最有效方法^[1-6]。

研究表明，人工合成的具有21～22個核苷酸序列的siRNA沒有細胞毒性，并且能夠有效的實現RNA干擾并達到基因治療的目的^【7-9】。盡管如此，由于siRNA本身不能進入靶向進入病變組織的功能，在臨床應用方面受到了極大的制約^【10-12】。近年來，非病毒類陽離子基因載體已經應用在了siRNA傳遞體系中，如PEG-PLL和PEG-PEI^【13-14】。

PEI類載體已經被證明了在質粒轉染體系中具有很好的效果，并在siRNA轉染方面也起到一定的作用，但是聚陽離子帶有的大量的正電荷，當劑量增大時會與細胞表面有強烈的作用而導致細胞死亡，因此，在PEI表面進行修飾遮蔽一部分正電荷能夠有效的降低細胞毒性^【15-18】。

發明內容

本發明的目的是尋找低毒性，轉染效率高，靶向性和pH敏感性強的非病毒類基因載體。

本發明選用超支化聚乙烯亞胺改性的超支化聚乙烯亞胺(PEI)-聚谷氨酸芐酯(PBLG)的共聚物PEI-PBLG，選取PEI-25k和Lipofectamine2000作為對照，介導熒光素酶siRNA進行基因沉默。我們發現PEI-PBLG相對PEI-25k能夠有效提高siRNA沉默效率，并降低了細胞毒性。

本發明提供了一種兩親性高分子陽離子聚合物的應用，其特征在于，所述的一種兩親性高分子陽離子聚合物作為siRNA轉染載體；

所述的兩親性高分子陽離子聚合物是分子量為25000的超支化聚乙烯亞胺(PEI)與聚谷氨酸芐酯(PBLG)的共聚物PEI-PBLG，其中，所述的超支化聚乙烯亞胺與聚谷氨酸芐酯的質量比為6∶4；所述的兩親性高分子陽離子聚合物的尺寸為150-250nm；

所述的siRNA為沉默熒光素酶的Luc?siRNA，其序列為5′-CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT-3′。對照物為Rev?siRNA，其序列為5′-AGCUUCAUGAGUCGCAUUCdTdT-3′。

所述的一種兩親性高分子陽離子聚合物的制法：用參考文獻[19]提供的方法制備。

本發明提供的一種兩親性高分子陽離子聚合物作為siRNA轉染載體的用法，步驟和條件如下：

(1)用常規方法合成siRNA；

(2)兩親性高分子陽離子聚合物/siRNA復合顆粒的制備

取所述的兩親性高分子陽離子聚合物加水溶解至濃度為1mg/mL，用孔徑為0.22μm的微孔濾膜過濾除菌；用無菌蒸餾水配制濃度為0.1mg/mL的siRNA水溶液，按照所述的兩親性高分子陽離子聚合物：siRNA的質量比為1.25∶1～40∶1，將所述的兩親性高分子陽離子聚合物的水溶液和siRNA水溶液按上述溶質質量比混合，把該混合水溶液置室溫放置20分鐘，進一步促進兩親性高分子陽離子聚合物與siRNA復合物顆粒的形成，得到一種含兩親性高分子陽離子聚合物/siRNA復合物顆粒；

(3)一種兩親性高分子陽離子聚合物作為siRNA轉染載體

(1)細胞的培養

復蘇細胞，在含有體積分數為10％的小牛血清的DMEM細胞培養液中并在含體積百分數為5％的CO₂、溫度為37℃的孵箱中連續培養；

(2)體外轉染

轉染前24小時內，將細胞按1×10⁴個細胞/孔種于96孔細胞培養板中，置于含體積百分數為5％的CO₂、溫度為37℃的孵箱中連續培養至80～90％融合；轉染時，吸棄前一天加注的細胞培養板中的培養液，用PBS洗滌兩次后，加入兩親性高分子陽離子聚合物/siRNA復合顆粒，以及含有體積百分數為10％FBS的高糖DMEM培養液，繼續培養24小時，加入復合顆粒6h換液作為對照實驗。

(3)體外轉染效率的測定

取出培養板，吸去培養液，PBS洗滌2次，加入50μL細胞裂解液裂解，吹打均勻后取出20μL至1.5mL離心管中，然后加入100μL熒光素底物，用光度計測定轉染效率；