[發明專利]一種北冬蟲夏草誘變菌株及培育方法

有效

• 申請號: 200910067440.8
• 申請日: 2009-08-21
• 公開（公告）號: CN101690463A
• 公開（公告）日: 2010-04-07
• 發明（設計）人: 滕利榮;高陸;孟慶繁;逯家輝;王迪;金璐;張嬡莉;杜研;王彥峰;李珊珊;沈畏;劉海雕;白冰;朱明光;翟景波;高朝輝;姜麗艷;王貞佐;林鳳;任曉冬;郭偉良;張凱明
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: A01H15/00
• 分類號: A01H15/00;A01H1/06
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 陳宏偉

技術領域

本發明公開一種北冬蟲夏草誘變菌株，為一種新的菌株品種，本發明還提供了該菌株的培育方法，屬于微生物技術領域。?

背景技術

北冬蟲夏草(Cordyceps?militaris(L)Link)，又名蛹蟲草、北蟲草或武式蟲草，與冬蟲夏草同屬子囊菌亞門核菌綱球殼目麥角菌科蟲草屬，主要分布在我國的山西、陜西、吉林、河北、廣東等地。北冬蟲夏草是真菌寄生在昆蟲蛹或幼蟲尸體部分而形成的復合體。中醫常用的冬蟲夏草是珍貴的藥用真菌，但其自然資源稀少，價格昂貴，且人工培養非常困難，至今未能實現規模化生產。?

目前國內外人工培養北冬蟲夏草多以其中一種或兩種主要成分為評價指標。如果能夠獲得一株北冬蟲夏草菌株，經液態深層發酵培養后，其菌絲體產量、腺苷、蟲草多糖、蛋白質、甘露醇等有效成分含量均較野生北冬蟲夏草有明顯提高，將大大提高該北冬蟲夏草的經濟價值。?

發明內容

本發明的目的在于提供一種北冬蟲夏草誘變菌株，為一種新的菌株，其有效成分包括腺苷、多糖、蛋白和蟲草酸的含量及菌絲體干重均較原出發菌株有明顯提高。?

本發明還提供了該菌株的培育方法。?

本發明還公開了北冬蟲夏草誘變菌株多糖和腺苷提取的最佳工藝條件。?

本發明的北冬蟲夏草誘變菌株為：在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏登記號為CGMCC?NO.2909；分類：蛹蟲草；分類命名：Cordyceps?militaris(L.)Link；保藏日期2009年3月2日。?

本發明所述的北冬蟲夏草菌株培育方法，包括以下步驟：?

1)將保藏號為CGMCC?5.699北冬蟲夏草菌株，接種于PDA斜面，24-26℃恒溫箱中培養4-8天，向斜面試管中注入無菌生理鹽水，振蕩后用無菌脫脂棉過濾，稀釋成濃度為2×10⁷-4×10⁷個/mL的孢子懸液；?

2)在培養皿中加入亞硝基胍10mg及0.5mL丙酮后，用pH＝6.0無菌磷酸緩沖液9mL溶解亞硝基胍，亞硝基胍終濃度為1mg/mL，加入步驟1)中得到的孢子懸液1mL，開始誘變；分別誘變2-20min之后，取菌懸液于無菌蒸餾水中逐級稀釋，至濃?度為3×10⁴個/mL，PDA培養基平板培養3-4天后，將菌株于96孔板保存；?

3)利用平板初步篩選生長迅速的菌株；?

4)將篩選獲得的菌株在搖瓶中復蘇，傳代后26℃150rpm恒溫搖床中培養3～5天，得菌絲體。?

5)獲得的高產誘變北冬蟲夏草誘變菌株經過連續傳代，培養條件為26℃150rpm恒溫搖床中培養84h，測定菌絲體干重、多糖、甘露醇、腺苷以及蛋白質含量，考察誘變菌株的遺傳穩定性，從而最終確定目的菌株。?

本發明北冬蟲夏草誘變菌株的鑒定：?

將所得到的北冬蟲夏草誘變菌株和野生型原出發菌株的總DNA，并以10聚核苷酸隨機引物對總DNA進行隨機擴增多態DNA(RAPD)比較，確認DNA變異情況，驗證菌株在DNA水平上與原出發菌株存在差異，是一株能夠穩定遺傳的北冬蟲夏草誘變菌株。?

用全自動凱氏定氮儀測定北冬蟲夏草菌絲體中蛋白總量。利用分光光度法測定甘露醇含量。?

北冬蟲夏草誘變菌株的鑒定中，采用苯酚-氯仿法提取北冬蟲夏草誘變菌株CGMCCNO.2909和原出發菌株CGMCC?5.699的總DNA。以總DNA為模板，分別以10聚核苷酸隨機引物對其進行PCR擴增反應。反應產物用2％瓊脂糖凝膠電泳進行分離。選取的30個隨機引物中，每個引物至少重復兩次PCR反應，從擴增結果中篩選出條帶清晰，重復性良好，并具有差異性條帶的隨機引物。最后，切下北冬蟲夏草誘變菌株和原出發菌株的差異性條帶和空白條帶，凝膠回收差異性條帶后，利用與RAPD相同的擴增體系和擴增引物進行二次PCR擴增，差異性條帶依然存在，說明該北冬蟲夏草突變株和原出發菌株相比，在DNA水平上確實發生了改變，是一株不同于原出發菌株的北冬蟲夏草誘變菌株。?

本發明所述的高產優質北冬蟲夏草突變株的特征為：?