[發明專利]牛CAPN1基因作為背最長肌嫩度分子標記的鑒定方法及應用

有效

• 申請號: 200910067401.8
• 申請日: 2009-08-17
• 公開（公告）號: CN101624598A
• 公開（公告）日: 2010-01-13
• 發明（設計）人: 姜昊;張嘉保;趙志輝;劉穎;高妍;馬騰壑;秦立紅;戴立勝;張金玉;陳承禎
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12N15/57
• 分類號: C12N15/57;C12Q1/68
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技術領域

本發明屬于動物基因工程技術領域，具體涉及牛背最長肌嫩度相關基因CAPN1基因片段的克隆以及其在牛標記輔助選擇中的應用。

背景技術

有實驗證明(Wick?M等，J?Biol?Chem，1999，279：1567-1582)，肌原纖維中主要蛋白的降解是肉品嫩度提高的根本原因，特別是Z盤的降解弱化，肌原纖維間聯結蛋白(結蛋白和聯結蛋白)、肌原纖維內聯結蛋白(肌聯蛋白、伴肌動蛋白和肌鈣蛋白-T)的降解造成肌原纖維片斷化，構成肌原纖維結構完整性的這些蛋白質的降解是嫩化成熟的主要原因。也有實驗證實(Koomaraie?M，MeatSci，1993，32：93-104)，鈣蛋白酶體系是導致蛋白質降解、嫩度提高的關鍵酶。廖洪波等(廖洪波等，鈣蛋白酶和肉的成熟嫩化.肉類工業.2003.8：27-29)認為，在宰后成熟的過程中鈣蛋白酶(CAPN1)的活性顯著下降。CAPN1活性下降，則是其發揮水解作用的體現。

Pringle?T.D等(Pringle?T?D等，Calcium?activated?tenderization?ofstrip?loin，top?sirtoin，and?top?sirloin，and?top?round?steaks?in?diversegenotypes?of?cattle.J?Anim?Sci，1999，77：3230-3237)用Angus和Brahman及其雜交牛為對象進行試驗，發現CAPN1的活性與嫩度具有相關性。Page等(PageB?T等，Evaluation?of?single-nucleotide?polymorphisms?in?CAPN1?forassociation?with?meat?tenderness?in?cattle.J?Anim?Sci，2002，80(12)：3077-3085)利用皮埃蒙特和安格斯牛的雜交后代種群作為研究對象，對CAPN1基因進行SNP分析時發現，此基因中存在38個SNP位點，其中2個位點與肉的嫩度相關性極大，說明CAPN1基因序列的差異可能是產生同一物種相同肌肉間嫩度差異的主要原因。

蔡欣等(蔡欣等，應用Nested和Touch?down?pcr技術分離牦牛CAPN1大亞基基因EST.西北農林科技大學學報(自然科學版)2005.33(2)14-18)應用Nested和Touch?down?PCR技術分離牦牛CAPN1大亞基基因EST。分離到的牦牛CAPN1基因EST序列與其他哺乳類對應序列具有較高的同源性，與奶牛、綿羊和豬的同源性分別為98％，96％和93％，與人和食蟹猴的同源性均為89％，該序列與偶蹄目動物對應序列的同源性較靈長類動物的高，可能在進化過程中更為保守。牦牛CAPN1部分編碼序列的分離與分析為牦牛CAPN1基因的進一步研究奠定了基礎。在今后的工作中，利用已獲得的EST序列，可以克隆牦牛CAPN1基因全長序列，進而進行此基因與牛肉嫩度相關性方面的分子遺傳標記研究。朱燕等(朱燕等，中國黃牛背最長肌中CAPN1?mRNA表達與嫩度的關系.南京農業大學學報.2006.29(2)：89-93)采用實時熒光定量PCR方法研究了中國黃牛背最長肌中CAPN1?mRNA表達與嫩度的關系。結果表明，CAPN1?mRNA表達量與宰后第3天的牛肉嫩度高度相關(r＝0.1855)。酪蛋白底物酶原分析表明，不同肌肉的CAPN1潛在酶活性存在很大差異。CAPN1?mRNA的表達可能是影響牛肉嫩度的主要因素。實驗還發現CAPN1產生的降解條帶有一定的差別。表明CAPN1在不同黃牛個體中蛋白水平的表達也存在差異，從另一方面也證實了肉的嫩化主要酶可能是CAPN1。

發明內容

本發明的目的在于克隆牛背最長肌嫩度相關基因CAPN1基因片段，尋找CAPN1基因的突變位點以及作為牛背最長肌嫩度相關基因的多態性檢測方法，為牛標記輔助育種提供一種有用的分子標記。

本發明通過以下技術方案實現：

一種牛背最長肌嫩度相關基因CAPN1的一部分DNA序列如表SEQ?ID?NO：1所示。

PCR擴增CAPN1基因的目的片段全長為520bp，其序列如SEQ?ID?NO：i所示。

所獲得CAPN1基因片段的DNA下列中有如表SEQ?ID?NO：1所述的A166-G166的堿基突變，導致PsuI-RFLP(Restriction?Fragment?Length?Polymorphism)多態性的產生。