[發(fā)明專利]利用抗菌肽制備細菌菌影的方法及應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910067286.4
• 申請日: 2009-07-15
• 公開（公告）號: CN101658668A
• 公開（公告）日: 2010-03-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 雷連成;杜崇濤;韓文瑜;馮新;謝芳;江麗娜
• 申請（專利權(quán)）人: 吉林大學
• 主分類號: A61K39/02
• 分類號: A61K39/02;A61K39/108;A61K47/46;A61P31/04
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司
• 代理人: 陳宏偉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種利用抗菌肽制備細菌菌影的方法及應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。?

背景技術(shù)

抗菌肽(antibacterial?peptides)，廣義上是指存在于生物體內(nèi)具有抵御外界微生物侵害，清除體內(nèi)突變細胞的一類小分子多肽，被認為是從細菌到昆蟲乃至高等哺乳動物體內(nèi)均普遍存在的一類防御性多肽，是生物先天免疫防衛(wèi)系統(tǒng)的一個重要組成部分，稱之為“第二防御體系”和“第二免疫體系”。在誘導條件下，動物免疫防衛(wèi)系統(tǒng)產(chǎn)生一類對抗外源性病原體的防御性陽離子肽類活性物質(zhì)，是生物先天免疫防衛(wèi)系統(tǒng)的一個重要組成部分。?

抗菌肽分子量相對較小，一般小于10kDa，由基因編碼、核糖體合成，其理化性質(zhì)穩(wěn)定、水溶性好、熱穩(wěn)定、廣譜抗菌、抗病毒、抗癌能力，并具有活性濃度低，無致畸變作用，無蓄積毒性、不易引起病原產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點，已發(fā)現(xiàn)的抗菌肽具有的多種作用機制中，一般認為膜攻擊理論是抗菌肽的最主要作用途徑，同一種抗菌肽也可能通過多種途徑發(fā)揮作用，對于抗菌肽作用機制的研究還在深入進行。目前抗菌肽的研究主要集中在替代傳統(tǒng)抗生素，開發(fā)成一種具有巨大發(fā)展?jié)摿Φ男滦涂咕帯?

菌影(bacterial?ghost，BG)是一種新型的疫苗及佐劑形式，其實質(zhì)是一種不含胞漿及核酸等內(nèi)容物的空細胞體，它最大的特點是保留了和活菌一樣的完整內(nèi)外膜結(jié)構(gòu)，能夠有效刺激機體產(chǎn)生特異性和非特異性免疫應(yīng)答，抵抗病原微生物的侵襲。相對于傳統(tǒng)滅活疫苗來說，它的表面抗原結(jié)構(gòu)得到最大程度的保留，免疫原性高，并可在其內(nèi)部及外膜上負載外源抗原，成為優(yōu)良的抗原遞送載體，同時為聯(lián)合疫苗的研究提供研究平臺，在致病性微生物越來越難以控制的今天，菌影系統(tǒng)開始受到國內(nèi)外研究者的關(guān)注。?

目前傳統(tǒng)的細菌菌影的制備方法主要是利用噬菌體PhiX174的E基因作為裂解基因，E基因可表達一種由91個氨基酸編碼的膜蛋白，它能融合革蘭氏陰性菌內(nèi)膜和外膜，形成一種大小介于40～200nm的E特異性跨膜裂解通道。在滲透壓的作用下，細菌只剩下內(nèi)外膜結(jié)構(gòu)，其內(nèi)部空間失去了核酸、核糖體和其他內(nèi)容物，形成空影細胞，也即菌影。目前，國內(nèi)外在菌影制備方面已有很多成功的先例。目前，除大腸桿?菌外，很多革蘭氏陰性菌均能在裂解基因E作用下產(chǎn)生菌影，如：鼠傷寒沙門氏菌，肺炎克雷伯氏菌、霍亂弧菌、溶血性巴氏桿菌、多殺性巴氏桿菌、幽門螺桿菌等。?

但是傳統(tǒng)的菌影制備方法存在以下不足：要制備不同細菌的菌影，就需要構(gòu)建不同的裂解載體，如果沒有相應(yīng)的載體則無法制備該細菌的菌影；構(gòu)建裂解載體費時費力，操作繁復(fù)；只局限于制備革蘭氏陰性菌的菌影，限制了使用范圍。?

目前國內(nèi)外還沒有將抗菌肽技術(shù)用于制備菌影的報道。?

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明公開一種利用抗菌肽制備細菌菌影的方法，提供了一種新的細菌菌影制備方法。?

本發(fā)明還提供了利用抗菌肽制備細菌菌影的應(yīng)用，可以作為一種新的候選疫苗使用。?

本發(fā)明利用抗菌肽制備細菌菌影的方法，包括以下步驟：?

利用多肽合成或基因工程表達的方法，獲得抗菌肽；將細菌菌株培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD₆₀₀為0.4～0.6)時，加入抗菌肽，4℃作用過夜或室溫作用2～4h；離心收集菌體并用生理鹽水重復(fù)洗兩次，即制備成細菌菌影，冷凍干燥后保存于-20℃或-80℃?zhèn)溆谩?

本發(fā)明的利用抗菌肽制備細菌菌影的應(yīng)用，包括以下步驟：制備細菌菌影，免疫實驗動物，可刺激機體產(chǎn)生特異的體液免疫和細胞免疫，與滅活苗相比有相同的保護率，具有良好的免疫效果，可以作為一種新的候選疫苗。?

本發(fā)明的積極效果在于：?

按照傳統(tǒng)的細菌菌影的制備方法，要制備不同細菌的菌影，就需要構(gòu)建不同的裂解載體，如果沒有相應(yīng)的載體則無法制備該細菌的菌影；構(gòu)建裂解載體費時費力，只局限于制備革蘭氏陰性菌的菌影。本發(fā)明用抗菌肽替代傳統(tǒng)方法來制備細菌菌影，提供了一種新的細菌菌影制備方法，取得了良好的效果，并且操作簡單，可廣泛用于制備不同細菌的菌影，制備的細菌菌影具有良好的免疫效果，可以作為一種新的候選疫苗使用。?

附圖說明

圖1.正常豬胸膜肺炎放線桿菌的TEM照片(13000×)；?

圖2.利用抗菌肽Tachyplesin?I制備的豬胸膜肺炎放線桿菌菌影的TEM照片(13000×)；?

圖3.利用抗菌肽Catesbeianin-1制備的豬胸膜肺炎放線桿菌菌影的TEM照片(13000×)；?