[發明專利]一種制備短裸甲藻毒素單克隆抗體的方法

無效

• 申請號: 200910066698.6
• 申請日: 2009-03-27
• 公開（公告）號: CN101509031A
• 公開（公告）日: 2009-08-19
• 發明（設計）人: 周玉;張媛媛;潘風光;李巖松;盧士英;任洪林;柳增善
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12P21/08
• 分類號: C12P21/08;C07K16/14
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司
• 代理人: 趙 正

1、一種制備短裸甲藻毒素單克隆抗體的方法，其特征在于：采用如下步驟完成：

1)完全抗原的制備

免疫抗原(BTX-IgG)和檢測抗原(BTX-BSA)具體制備方法如下：

(1)混合液的制備：取0.5mg?BTX、0.08mg?N-羥丁二酰亞胺、0.15mg?N，N雙環乙烷碳二亞胺于0.5mL?DMF中混均，在10-30℃條件下孵育2h制成混合液，并將混合液平均分成兩等份；(2)載體蛋白反應液的制備：取0.4mg?IgG溶于0.5mL0.1mol/L?NaHCO₃緩沖液中，混勻后做為載體蛋白反應液；(3)將步驟(2)制備的載體蛋白反應液加入步驟(1)制備的混合液中，在10-30℃條件下孵育2h，所得產物為免疫抗原(BTX-IgG)，超濾離心去除未反應的物質，分裝后-20℃保存備用；(4)取0.4mg?BSA，溶于0.5mL0.1mol/L?NaHCO₃緩沖液中，混勻后做為載體蛋白反應液；(5)將步驟(4)制備的載體蛋白反應液加入步驟(1)制備的混合液中，在10-30℃條件下孵育2h，所得產物為檢測抗原(BTX-BSA)，超濾離心去除未反應的物質，分裝后-20℃保存備用；

2)動物免疫

(1)免疫動物為8周齡雄性BALB/C小鼠，免疫前斷尾采血作為陰性血清；

(2)配制免疫抗原標準液2μg/μL，首次免疫使用弗氏完全佐劑乳化免疫抗原，抗原佐劑比1：1，腹腔注射100μL/鼠，(3)18天后采用脾內注射法注射，首免21天后斷尾取血檢測效價；

3)取血清效價大于10⁴的被免疫小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞按常規方法融合，制備單克隆抗體。

2、根據權利要求1所述的的方法，其特征在于：脾內注射方法如下，將小鼠禁食禁水24小時，使用2％戊巴比妥鈉每只100μL將小鼠麻醉，待眨眼反射消失后，將小鼠俯臥固定于簡易操作臺上，對背部皮毛消毒，在背部中線左側0.5cm最后肋骨0.1cm處，沿體中軸向下剪開1cm長切口，用手輕輕按壓兩側腹壁，使脾臟暴露出腹腔，使用1mL注射器，注射10μL全抗原標準液，邊注射邊退針盡量使其均勻注入脾內，將脾臟放回腹腔，逐層縫合腹腔及皮膚。

3、根據權利要求1所述的方法，其特征在于：飼養細胞的制備是取12周齡以上，與骨髓瘤同系小鼠1-2只，挖去一只眼球放血，待血滴不出為止，拉頸處死，將鼠浸在75％酒精5min消毒，無菌條件下用消毒鑷子和剪刀剪開小鼠腹部外層皮膚，然后向上下兩側方向拉開小鼠皮膚，暴露腹膜，用消毒注射器抽取3mL無血清HT1640培養液，用鑷子將腹膜提起，將溶液注入小鼠腹腔內，一只手固定針筒，針頭停留在腹腔內，輕輕按摩腹壁1-2min，使巨噬細胞游出，然后用注射器抽回腹腔內液體，并進行3次沖洗，收集沖洗液，1000rpm離心5min，棄上清，用HAT培養液稀釋離心沉淀的細胞，并調整細胞濃度至1×10⁵個/mL，將細胞懸液按每孔100μl鋪板，放于37℃含5％的二氧化碳培養箱中培養。此細胞在融合前24h制備。

4、根據權利要求1所述的方法，其特征在于：免疫淋巴結B細胞懸液的制備是將免疫的BALB/C小鼠摘眼取血致死，收集血液于EP管中，37℃放置2h后離心分離血清，-20℃貯存備用，將猝死后小鼠浸入75％酒清中3min，無菌取腘淋巴結，放入載有200目銅網的無菌平皿內，加2mL基礎培養基將淋巴結浸潤，用膠棒將淋巴結研磨成漿狀，巴斯德吸管吹打分散細胞，轉移至50mL玻璃離心管內，1000g/min離心5min，重復洗2次，并計數細胞，最后用適量的RPMI-1640懸浮細胞，使成5×10⁷/mL，體積為2mL以上。