[發(fā)明專利]一種制備短裸甲藻毒素單克隆抗體的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910066698.6
• 申請(qǐng)日: 2009-03-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101509031A
• 公開(kāi)（公告）日: 2009-08-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周玉;張媛媛;潘風(fēng)光;李巖松;盧士英;任洪林;柳增善
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 吉林大學(xué)
• 主分類號(hào): C12P21/08
• 分類號(hào): C12P21/08;C07K16/14
• 代理公司: 吉林長(zhǎng)春新紀(jì)元專利代理有限責(zé)任公司
• 代理人: 趙 正

1、一種制備短裸甲藻毒素單克隆抗體的方法，其特征在于：采用如下步驟完成：

1)完全抗原的制備

免疫抗原(BTX-IgG)和檢測(cè)抗原(BTX-BSA)具體制備方法如下：

(1)混合液的制備：取0.5mg?BTX、0.08mg?N-羥丁二酰亞胺、0.15mg?N，N雙環(huán)乙烷碳二亞胺于0.5mL?DMF中混均，在10-30℃條件下孵育2h制成混合液，并將混合液平均分成兩等份；(2)載體蛋白反應(yīng)液的制備：取0.4mg?IgG溶于0.5mL0.1mol/L?NaHCO₃緩沖液中，混勻后做為載體蛋白反應(yīng)液；(3)將步驟(2)制備的載體蛋白反應(yīng)液加入步驟(1)制備的混合液中，在10-30℃條件下孵育2h，所得產(chǎn)物為免疫抗原(BTX-IgG)，超濾離心去除未反應(yīng)的物質(zhì)，分裝后-20℃保存?zhèn)溆茫?4)取0.4mg?BSA，溶于0.5mL0.1mol/L?NaHCO₃緩沖液中，混勻后做為載體蛋白反應(yīng)液；(5)將步驟(4)制備的載體蛋白反應(yīng)液加入步驟(1)制備的混合液中，在10-30℃條件下孵育2h，所得產(chǎn)物為檢測(cè)抗原(BTX-BSA)，超濾離心去除未反應(yīng)的物質(zhì)，分裝后-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

2)動(dòng)物免疫

(1)免疫動(dòng)物為8周齡雄性BALB/C小鼠，免疫前斷尾采血作為陰性血清；

(2)配制免疫抗原標(biāo)準(zhǔn)液2μg/μL，首次免疫使用弗氏完全佐劑乳化免疫抗原，抗原佐劑比1：1，腹腔注射100μL/鼠，(3)18天后采用脾內(nèi)注射法注射，首免21天后斷尾取血檢測(cè)效價(jià)；

3)取血清效價(jià)大于10⁴的被免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞按常規(guī)方法融合，制備單克隆抗體。

2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的的方法，其特征在于：脾內(nèi)注射方法如下，將小鼠禁食禁水24小時(shí)，使用2％戊巴比妥鈉每只100μL將小鼠麻醉，待眨眼反射消失后，將小鼠俯臥固定于簡(jiǎn)易操作臺(tái)上，對(duì)背部皮毛消毒，在背部中線左側(cè)0.5cm最后肋骨0.1cm處，沿體中軸向下剪開(kāi)1cm長(zhǎng)切口，用手輕輕按壓兩側(cè)腹壁，使脾臟暴露出腹腔，使用1mL注射器，注射10μL全抗原標(biāo)準(zhǔn)液，邊注射邊退針盡量使其均勻注入脾內(nèi)，將脾臟放回腹腔，逐層縫合腹腔及皮膚。

3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：飼養(yǎng)細(xì)胞的制備是取12周齡以上，與骨髓瘤同系小鼠1-2只，挖去一只眼球放血，待血滴不出為止，拉頸處死，將鼠浸在75％酒精5min消毒，無(wú)菌條件下用消毒鑷子和剪刀剪開(kāi)小鼠腹部外層皮膚，然后向上下兩側(cè)方向拉開(kāi)小鼠皮膚，暴露腹膜，用消毒注射器抽取3mL無(wú)血清HT1640培養(yǎng)液，用鑷子將腹膜提起，將溶液注入小鼠腹腔內(nèi)，一只手固定針筒，針頭停留在腹腔內(nèi)，輕輕按摩腹壁1-2min，使巨噬細(xì)胞游出，然后用注射器抽回腹腔內(nèi)液體，并進(jìn)行3次沖洗，收集沖洗液，1000rpm離心5min，棄上清，用HAT培養(yǎng)液稀釋離心沉淀的細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10⁵個(gè)/mL，將細(xì)胞懸液按每孔100μl鋪板，放于37℃含5％的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。此細(xì)胞在融合前24h制備。

4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：免疫淋巴結(jié)B細(xì)胞懸液的制備是將免疫的BALB/C小鼠摘眼取血致死，收集血液于EP管中，37℃放置2h后離心分離血清，-20℃貯存?zhèn)溆?，將猝死后小鼠浸?5％酒清中3min，無(wú)菌取腘淋巴結(jié)，放入載有200目銅網(wǎng)的無(wú)菌平皿內(nèi)，加2mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基將淋巴結(jié)浸潤(rùn)，用膠棒將淋巴結(jié)研磨成漿狀，巴斯德吸管吹打分散細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至50mL玻璃離心管內(nèi)，1000g/min離心5min，重復(fù)洗2次，并計(jì)數(shù)細(xì)胞，最后用適量的RPMI-1640懸浮細(xì)胞，使成5×10⁷/mL，體積為2mL以上。