[發明專利]一種從組分Ⅰ+Ⅲ或組分Ⅲ中提取人免疫球蛋白的方法

有效

• 申請號: 200910065613.2
• 申請日: 2009-07-31
• 公開（公告）號: CN101648998A
• 公開（公告）日: 2010-02-17
• 發明（設計）人: 呂勇;時凱;劉國榮;張志龍;陳慧珍
• 申請（專利權）人: 鄭州邦和生物藥業有限公司
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;C07K1/34;C07K1/14
• 代理公司: 鄭州天陽專利事務所（普通合伙）
• 代理人: 聶孟民

1.一種從組分Ⅰ+Ⅲ或組分Ⅲ中提取人免疫球蛋白的方法，其特征在于，由以下步驟實現：

①組分Ⅰ+Ⅲ或組分Ⅲ沉淀的溶解；

②去除組分Ⅰ：調整溶解液pH至4.8～5.1，降溫，加入乙醇至乙醇濃度為8～9％，復測并校正pH至4.8～5.1，攪拌反應降溫至-2.0℃～2.5℃，之后，每千升反應液中加入硅藻土4kg和珍珠巖4kg，攪拌反應，之后，壓濾分離組分Ⅰ，收集上清液棄去沉淀；

③組分Ⅲ的分離：計量上清液體積，調整上清液pH5.05～5.25，加入乙醇至乙醇濃度為13～15％，調整加乙醇后的溶液pH5.05～5.25，控制溫度-2.0℃～-4.0℃，攪拌反應2小時以上，之后，每千升反應液中加入硅藻土3kg和珍珠巖3kg，攪拌后，壓濾分離組分Ⅲ，收集上清液，棄去沉淀；

④組分II的分離：計量上清液體積，加入氯化鈉至濃度4.5～5.5g/L，調pH6.8～7.2，加入95％乙醇至乙醇濃度為17～19％，降溫至-5.0～-6.0℃，攪拌反應2小時以上，壓濾分離組分Ⅱ，收集壓濾機上的沉淀；

⑤組分II沉淀溶解過濾：組分Ⅱ沉淀用5～10倍沉淀重量2～8℃注射用水溶解，校正pH值至4.9～5.2，溶解后板框過濾；

⑥超濾、透析、濃縮：過濾液用截流分子量為50KD超濾器進行濃縮、透析，后濃縮至蛋白濃度60～80g/L，調整pH至4.80～5.10，添加山梨醇，山梨醇添加量為40～60g/L，用注射用水調整的蛋白濃度在40～60g/L；

⑦組分Ⅱ加溫提純：將步驟⑥中的溶液溫度升至51～53℃恒溫3小時，恒溫結束后降至室溫；

⑧純化：用0.01M的磷酸氫二鈉緩沖液稀釋溶液，校正溶液pH5.10～5.20，降溫至0～1℃，加入95％乙醇至乙醇濃度14％～15％，加入NaCl使其含量為1.5～1.8g/L，繼續降溫至-4.0℃～-5.0℃，靜置上清液抽至反應罐中，壓濾，收集壓濾液；

⑨超濾透析：將壓濾液用7～8倍2～8℃注射用水連續透析，濃縮至蛋白濃度60～80g/L，再進行病毒滅活步驟后，即可進行除菌分裝。

2.根據權利要求1所述的從組分Ⅰ+Ⅲ或組分Ⅲ中提取人免疫球蛋白的方法，其特征在于，由以下步驟實現：

①組分Ⅰ+Ⅲ沉淀的溶解，方法是，將組分Ⅰ+Ⅲ用15倍沉淀量的5℃的0.01M磷酸氫二鈉溶液充分溶解；

②組分Ⅰ分離：方法是，用pH值為4.0的醋酸緩沖液調節pH值為4.90～5.00，降溫至0～1℃，加入95％乙醇至乙醇濃度為8.5％，復測pH值在4.90～5.10之間，攪拌反應降溫至-1.8～2.2℃，攪拌反應時間為2.5小時，之后，每千升反應液中加入硅藻土4Kg和珍珠巖4Kg，攪拌30分鐘，再用8.5％平衡液500L，加硅藻土4kg對壓濾機上濾板循環清洗，平衡后壓濾，出液溫度-1.0℃～-2.0℃，壓濾完后用預冷潔凈空氣吹干濾板35分鐘，用8.5％平衡液500L清洗濾板2次，回收洗液，與壓濾液合并，收集上清液，棄去沉淀；

所說的8.5％平衡液是含以體積計：乙醇8.5％、磷酸氫二鈉0.005mol/L及余量為水制成，pH4.90～5.10，溫度-1.5～-2.5℃的溶液；

③組分Ⅲ的分離：計量步驟②中收集的上清液體積，用1mol/L?NaOH調整溶液pH為5.10～5.20，再加入95％乙醇至乙醇濃度為14％，控制溫度-3℃，攪拌反應2.5小時，之后，每千升反應液中加入硅藻土3Kg和珍珠巖3Kg，攪拌30分鐘，然后，用14％平衡液500L，加硅藻土5Kg對壓濾機上濾板循環，用預冷潔凈空氣吹干濾板，平衡后壓濾，出液溫度-2.0℃～-3.0℃，壓濾完后用預冷潔凈空氣吹干濾板15分鐘，用14％平衡液500L清洗濾板2次，回收洗液，與壓濾液合并，收集上清液，棄去沉淀；

所說的14％平衡液是含以體積計：乙醇14％、磷酸氫二鈉：0.005mol/L及余量為水制成，pH5.05～5.25，溫度-3.0℃～-4.0℃的溶液；

④組分II的分離：方法是，計量步驟③中收集的上清液體積，按5g/L量加入氯化鈉，用0.5M氫氧化鈉調pH6.80～7.20，加入95％乙醇至終乙醇濃度為18％，降溫至-5.0～-6.0℃，攪拌反應2小時以上，再用18％平衡液400～600L，加硅藻土5～6Kg，對壓濾機上濾板循環清洗，用預冷潔凈空氣吹干濾板，清洗后壓濾，出液溫度-3.5℃～-4.5℃，壓濾完后用預冷潔凈空氣吹干濾板15分鐘，再用18％平衡液500L清洗濾板，用預冷潔凈空氣吹干濾板35分鐘，收集壓濾機上的沉淀；

所說的18％平衡液是含以體積計：乙醇18％、磷酸氫二鈉：0.005mol/L、氯化鈉6g/L及余量為水制成，pH6.8～7.2，溫度-5.0℃～-6.0℃的溶液；

⑤組分II沉淀溶解過濾：方法是，將步驟④中收集壓濾機上的沉淀物用8倍沉淀物重量的2～8℃注射用水溶解，再用pH4.0的醋酸緩沖液校正pH值至5.00～5.10，攪拌溶解5小時，板框過濾，過濾后，用2～8℃注射用水沖洗板框，沖洗液并入到過濾液中；

⑥超濾、透析、濃縮：方法是，將步驟⑤中收集的過濾液用6倍的2～8℃注射用水連續透析，透析后濃縮至蛋白濃度60～80g/L，再用0.5mol/L?HCl或0.5mol/L?NaOH調pH至4.90～5.00，添加山梨醇，山梨醇添加量為40～60g/L，用注射用水調整蛋白濃度為40～50g/L；

⑦組分Ⅱ加溫提純：方法是，先將步驟⑥中得到的濃度為40～50g/L的蛋白液升溫至52℃，恒溫3小時后，降溫至18～25℃，再用0.01M的磷酸氫二鈉緩沖液稀釋，蛋白濃度至15～20g/L，用pH4.0緩沖液校正溶液pH至5.10～5.20，降溫至0～1℃，加入95％乙醇調至乙醇在溶液中的濃度為14.5％，再加入NaCl使NaCl在溶液中的含量為1.65g/L，繼續降溫至-4.0～-5.0℃后，再加入珍珠巖，珍珠巖加入量為3g/L，攪拌1～2小時，靜置后，抽上清液至反應罐中，再用14.5％的平衡液平衡壓濾機后將上清液壓濾，收集壓濾液；

所說的14.5％平衡液是含以體積計：14.5％的乙醇、1.8g/L氯化鈉及余量為水制成，pH為5.1～5.2，溫度-4.0～-5.0℃的溶液；

⑧超濾透析：方法是，將步驟⑦中收集的壓濾液用8倍2～8℃注射用水連續透析，濃縮至蛋白濃度60～80g/L，病毒滅活后，分裝即可。

3.根據權利要求1所述的從組分Ⅰ+Ⅲ或組分Ⅲ中提取人免疫球蛋白的方法，其特征在于，由以下步驟實現：

①組分Ⅲ沉淀的溶解：將組分Ⅲ沉淀用15倍沉淀量的5℃的0.01M磷酸氫二鈉溶液充分溶解；

②組分Ⅲ的分離：方法是，計量步驟①中溶解液的體積，用1mol/L?NaOH調整溶液pH為5.10～5.20后，再加入95％乙醇，調乙醇至在溶液中的濃度為14％，在溫度-2.0℃～-4.0℃攪拌反應2小時以上后，每千升反應液中加入硅藻土3Kg和珍珠巖3Kg，攪拌30分鐘，用14％平衡液500L，加硅藻土5Kg對壓濾機上濾板循環清洗，平衡后壓濾，出液溫度為-2.0℃～-3.0℃，壓濾后，用預冷潔凈空氣吹干濾板15分鐘，再用14％平衡液500L清洗濾板2次，回收洗液，與壓濾液合并，收集上清液，棄去沉淀物；

③組分II的分離：方法是，計量步驟②中收集的上清液體積，按5g/L量加入氯化鈉，用0.5M氫氧化鈉調pH6.90～7.10，加入95％乙醇至終乙醇濃度為18％，降溫至-5.0～-6.0℃，攪拌反應2小時以上，再用18％平衡液500L，加硅藻土5Kg，對壓濾機上濾板循環清洗，用預冷潔凈空氣吹干濾板，平衡后壓濾，出液溫度-3.5℃～-4.5℃，壓濾完后用預冷潔凈空氣吹干濾板15分鐘，再用18％平衡液500L清洗濾板，用預冷潔凈空氣吹干濾板35分鐘，收集壓濾機上的沉淀；

④組分II沉淀溶解過濾：方法是，將步驟③中收集壓濾機上的沉淀物用8倍沉淀物重量的2～8℃注射用水溶解，再用pH4.0的醋酸緩沖液校正pH值至5.00～5.10，攪拌溶解4小時以上，板框過濾，過濾后，用2～8℃注射用水沖洗板框，沖洗液并入到過濾液中；

⑤超濾、透析、濃縮：方法是，將步驟④中收集的過濾液用6倍的2～8℃注射用水連續透析，透析后濃縮至蛋白濃度60～80g/L，再用0.5mol/L?HCl或0.5mol/L?NaOH調pH至4.90～5.00，添加山梨醇，山梨醇添加量為40～60g/L，用注射用水調整蛋白濃度為40～50g/L；

⑥組分Ⅱ加溫提純：方法是，先將步驟⑤中得到的濃度為40～50g/L的蛋白升溫至52℃，恒溫3小時后，降溫至18～25℃，再用0.01M的磷酸氫二鈉緩沖液稀釋，蛋白濃度至15～20g/L，用pH4.0緩沖液校正溶液pH至5.10～5.20，降溫至0～1℃，加入95％乙醇調至乙醇在溶液中的濃度為14.5％，再加入NaCl使NaCl在溶液中的含量為1.65g/L，繼續降溫至-4.0～-5.0℃后，再加入珍珠巖，珍珠巖加入量為3g/L，攪拌1～2小時，靜置后，抽上清液至反應罐中，再用14.5％的平衡液平衡壓濾機后將上清液壓濾，收集壓濾液；

⑦超濾透析：方法是，將步驟⑥中收集的壓濾液用8倍2～8℃注射用水連續透析，濃縮至蛋白濃度60～80g/L，病毒滅活后，分裝即可。