[發明專利]多種腫瘤標志物聯合檢測液相芯片及其制備方法

有效

• 申請號: 200910064647.X
• 申請日: 2009-04-14
• 公開（公告）號: CN101526535A
• 公開（公告）日: 2009-09-09
• 發明（設計）人: 王韞燁;王學銘
• 申請（專利權）人: 河南省豫康生物工程技術有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/546;G01N33/531
• 代理公司: 鄭州大通專利商標代理有限公司
• 代理人: 樊 羿

1.一種多種腫瘤標志物聯合檢測液相芯片，其特征在于，主要包括下列成分：

①耦聯捕獲抗體的微球??含有分別耦聯了AFP捕獲抗體的微球、耦聯了CEA捕獲抗體的微球、耦聯了CA125捕獲抗體的微球、耦聯了CA153捕獲抗體的微球、耦聯了CA19-9捕獲抗體的微球、耦聯了CA242捕獲抗體的微球、耦聯了CA72-4捕獲抗體的微球、耦聯了PSA捕獲抗體的微球、耦聯了HGH捕獲抗體的微球、耦聯了beta-HCG捕獲抗體的微球中的至少兩種，耦聯不同捕獲抗體的微球則具有不同的顏色編碼；

②生物素標記的檢測抗體??生物素分別標記的AFP、CEA、CA125、CA153、CA19-9、CA242、CA72-4、PSA、HGH、beta-HCG檢測抗體中的至少兩種，且與①中捕獲抗體相對應；

③鏈親和素藻紅蛋白；以及

④溶質含量為1～10wt‰的不含蛋白成分的植物性水溶膠,或為單糖水溶液/多單糖混合水溶液。

2.根據權利要求1所述的多種腫瘤標志物聯合檢測液相芯片，其特征在于，所述植物性水溶膠為不含蛋白成分的魔芋膠、香豆膠、白及膠、毛膠薯蕷多糖膠、阿拉伯膠、果膠、田菁膠、黃蓍膠、刺梧桐膠、羅望子膠、卡拉膠、瓜爾豆膠、刺槐豆膠、亞麻籽膠、精制海藻膠中的至少一種。

3.根據權利要求1所述的多種腫瘤標志物聯合檢測液相芯片，其特征在于，所述單糖水溶液是甘露糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖及其相應的糖醛酸中的任意一種的水溶液；所述多單糖混合水溶液為甘露糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖及其相應的糖醛酸中的兩種或兩種以上按比例組成的混合水溶液。

4.權利要求1所述的多種腫瘤標志物聯合檢測液相芯片的制備方法，包括以下步驟：

（1）水溶膠的提純、配制

選取或制備植物膠，去除所含蛋白成分及雜質，滅菌，調節至一定濃度，備用；

（2）捕獲抗體與微球耦聯

①微球活化、修飾??取熒光編碼的微球原液渦漩分散10～30s，移取50μl以≥8000g離心2～4分鐘，移去上清液；加入80～120μl水，渦旋10～30s，≥8000g離心2～4分鐘，移去上清液，重復加水洗滌1～2次；向洗滌過的微球中加入60～100μl?0.1mol/L?pH5.0的PBS，渦旋10～30s后，再加入10～15μl?50mg/ml?sulfo-NHS水溶液，渦旋10～30s，隨后加入10～15μl?50mg/ml?EDC水溶液，渦旋10～30s后，于36～38℃下避光孵育20～30分鐘，≥8000g、離心2～3分鐘，移去上清液；加入200～300μl?100mmol/L、pH6.3?MES，渦旋10～30s，≥8000g離心2～4分鐘，移去上清液，如此重復洗滌1～2次；

②活化捕獲抗體???預先去除待耦聯的捕獲抗體中所含的氨基小分子及其它雜蛋白，再以0.05mol/L、pH6.3?MES稀釋至40ug/ml，備用；

③耦聯???向已活化的微球中加入450～550μl相對應的捕獲抗體，渦旋10～30s，36～38℃下避光孵育1.5～3小時；

④封閉位點??向孵育后的溶液中加入1～2ml?PBS-BN，渦旋10～30s，≥8000g離心2～4分鐘，棄上清液；再加入0.5～1ml?PBS-BN，渦旋10～30s，≥8000g離心2～4分鐘，棄上清液；

⑤調節濃度??上步所得耦聯微球重懸于PBS-BN?或水溶膠中，渦旋10～30s，計數微球濃度；

（3）生物素標記抗體的制備

①檢測抗體預處理??對含疊氮鈉、Tris、甘氨酸等含氨基或其它小分子雜質的檢測抗體，用0.01M、pH7.4?PBS充分透析；對含有牛血清白蛋白及其它大分子雜質的檢測抗體進行純化分離；

②抗體濃度標定??標定測定檢測抗體的濃度后，以0.01M、pH7.4?PBS將抗體濃度調節至2mg/ml；

③生物素標記抗體??取預處理過的檢測抗體250μl，加入25μl的2mg/ml?NHS-Biotin?DMSO溶液，混勻，2～8℃下避光反應1.5～3小時；

④透析??以0.01M、pH7.0?PBS對生物素標記的抗體進行透析，去除游離的生物素，并標定生物素標記的抗體的濃度；

（4）制劑

將所需要的各種耦聯微球按一定比例混合，并以植物性水溶膠，或單糖水溶液/多單糖混合水溶液調節微球濃度，分散混勻，使每種耦聯微球的濃度為2×10³～4×10³個/ml，溶膠質含量為1～10wt‰，置2～8℃下避光保存；或將所需的各種耦聯微球按一定比例混合，并加入種類及數量均對應的生物素標記抗體，以及對應數量的鏈親和素藻紅蛋白，再加植物性水溶膠，或單糖水溶液/多單糖混合水溶液調節微球濃度，分散混勻后，使每種耦聯微球的濃度為1×10³～2×10³個/ml，溶膠質含量為1～10wt‰，于2～8℃下避光保存。