[發明專利]外植體的表面滅菌方法

無效

• 申請號: 200910064007.9
• 申請日: 2009-01-05
• 公開（公告）號: CN101461329A
• 公開（公告）日: 2009-06-24
• 發明（設計）人: 胡士敬;趙莉;王芳;許朝斌;王肖東;邢紅梅;郭勇;任兵茹;趙烈平;谷磊
• 申請（專利權）人: 靈寶市華寶產業有限責任公司
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 鄭州聯科專利事務所（普通合伙）
• 代理人: 王聚才

技術領域

本發明屬于植物組織培養技術領域，具體涉及外植體的表面滅菌方法。

背景技術

植物組織培養用的外植體無論是取自田間還是室內，其表面通常都帶有微生物。這些污染源一旦帶入培養基，便會造成培養基污染，是無菌組織培養的一大障礙。因此，外植體必須要經過嚴格的表面滅菌處理，再經無菌操作手續接種到培養基上。依據傳統的表面滅菌處理技術，采來的外植體除去不用的部分之后，還需對其進行以下幾個步驟的處理：(1)自來水下長時間沖洗，必要時用適當的刷子刷洗，硬質材料可用刀刮，然后置于自來水龍頭下流水沖洗幾分鐘至數小時，沖洗時間視材料清潔程度而宜。一些多年生的木本植物材料，沖洗后可先用洗衣粉、肥皂或吐溫等進行洗滌。易漂浮或細小的材料，裝入紗布袋內沖洗。(2)植物材料浸入70％的酒精中滅菌10-30秒，然后用無菌水沖洗2-3次。(3)用滅菌劑處理，常見的表面滅菌劑有酒精、升汞、雙氧水以及次氯化物。用升汞液滅菌后的材料需要用無菌水漂洗8-10次，每次不少于3分鐘，以盡量去除殘毒，而其他滅菌劑處理過的外植體用無菌水漂洗3-4次即可。

然而大量的事實表明，盡管在植物組培過程中盡量使無菌條件更完善，但是污染還是經常發生，有時甚至是整個實驗室的組培苗突出污染而全部死亡，造成無法挽回的巨大損失。有關研究人員認為：材料內部滅菌處理不好所造成的污染占污染總數的1/3～1/2，在正常滅菌條件下依然存活的內生菌污染約占1/4。其原因之一就是因為采來的外植體除去不用的部分之后先用大量的自來水沖洗，雖然能夠清除肉眼看得見的污垢，但自來水中原有的微生物以及從外植體上沖洗下來的微生物會沿著植物導管進入外植體內部。如此一來，即便后續的浸泡消毒工作做得多么充分也很難將進入內部的微生物殺死，最終導致污染發生，組培操作失敗。

發明內容

本發明針對作為外植體的離體植物器官(根、莖、葉、花、果實、種子等)提供了一種消毒滅菌方法，從而大幅度降低植物組織培養的污染率。

為了達到上述目的，本發明所采用的技術方案為：一種外植體的表面滅菌方法，其操作步驟包括外植體表面清洗、放入消毒劑溶液浸泡殺菌、浸泡后用無菌水沖洗，采來的外植體除去不用的部分之后，直接用濃度為70-75％的酒精溶液清洗，然后再放入可用于外植體滅菌的消毒劑溶液中浸泡殺菌。

所述外植體經酒精清洗之后、放入消毒劑中浸泡殺菌之前，放入濃度為70-75％的酒精溶液中浸泡1-15min。

所述的消毒劑為次氯酸鈉、升汞、次氯酸鈣、溴水中的任意一種。

所述的消毒劑溶液中還含有0.1-0.5％的吐溫，以促進消毒劑溶液在外植體表面的鋪展、浸潤。

按照本發明所提供的技術方案，采來的外植體除去不用的部分之后，不似傳統方法那樣先用大量的自來水沖洗甚至用肥皂或洗衣粉清洗，而是直接用濃度為70-75％的酒精溶液清洗。清洗與滅菌同步開展，這樣可以避免自來水中或是外植體上沖洗下來的微生物沿著外植體的毛細管進入植物器官內部。傳統觀念認為酒精溶液的強滲透作用會傷害植物細胞。但經實驗證實，這種傷害十分有限，只要在植入培養基前將傷口部分切除即可，并不影響組培成功率。對于一些老熟的材料，酒精清洗后、浸泡滅菌之前可以先用濃度為70-75％酒精溶液浸泡1-15min，在起到漂洗作用的同時，提高滅菌效果。浸泡滅菌選擇除酒精以外的常見植物滅菌劑或抗菌素即可，如次氯酸鈣、次氯酸鈉、升汞、雙氧水、溴水等。

具體實施方式

實施例1

取棗樹莖段，用75％的酒精溶液擦洗去表面污垢之后，將莖段放入70％的酒精溶液中浸泡15min，然后放入含升汞0.1％、吐溫0.5％的消毒液中浸泡5min。浸泡消毒過程中不時用玻璃棒輕輕攪動，以促進材料各部分與消毒溶液充分接觸，驅除氣泡，使消毒徹底。在快到時間之前1-2分鐘將消毒液傾出，傾凈后立即倒入無菌水輕搖涮洗。無菌水涮洗每次3min左右，涮洗8-10次。整個滅菌過程在無菌條件下操作。

實施例2

采蝴蝶蘭花梗切去不要的部分，然后用70％的酒精溶液擦洗去表面污垢。清洗干凈后將花梗放入75％的酒精溶液中浸泡1min，然后放入次氯酸鈉濃度為6％、吐溫濃度為0.1％的消毒溶液中浸泡10min。浸泡過程中不時用玻璃棒輕輕攪動，以促進材料各部分與消毒溶液充分接觸，驅除氣泡，使消毒徹底。在快到時間之前1-2分鐘，將次氯酸鈉溶液傾出后，立即倒入無菌水輕搖涮洗。無菌水涮洗每次3min左右，涮洗3-5次。整個滅菌過程在無菌條件下操作。

實施例3