[發明專利]一種抗人組織激肽釋放酶單克隆抗體及其制備

有效

• 申請號: 200910063377.0
• 申請日: 2009-07-31
• 公開（公告）號: CN101928346A
• 公開（公告）日: 2010-12-29
• 發明（設計）人: 汪道文;張琴
• 申請（專利權）人: 華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院
• 主分類號: C07K16/40
• 分類號: C07K16/40;C12N15/06;C12P21/08
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 王和平

技術領域

本發明涉及一種抗人組織激肽釋放酶的單克隆抗體及其制備方法，屬于免疫化學技術領域。?

背景技術

人組織激肽釋放酶是一個大的多基因家族，由15個成員成。人和動物組織激肽釋放酶中只有一種酶能有效地使激肽原釋放生物活性物激肽。在人體內該酶稱為胰/腎激肽釋放酶，新的統一命名KLK1編碼hk1蛋白。hk1能水解低分子量激肽原使之生成激肽，而激肽與血管平滑肌細胞膜上的舒緩激肽B2受體結合后，可使血管平滑肌NO增多，進而通過cGMP第二信使途徑舒張血管，達到降壓的目的。遺傳高血壓及自發性高血壓病人都可見激肽釋放酶含量下降。近年來的研究結果表明，hK1除具有降血壓作用外，對腎臟損傷的修復也具有明顯的治療作用，還可降低膠原密度、心肌細胞體積和左心室內徑，并能增大毛細血管密度，從而有利于心臟重塑。因此，hK1的在心血管疾病診斷和治療方面具有廣闊的應用前景。?

鑒于HK1在心血管疾病診斷和治療方面的應用前景，國外已有關于HK1含量檢測的ELISA試劑盒，但是其操作過程繁瑣并且價格昂貴難于獲得。目前，國內尚無此類的高效檢測試劑盒。而建立具有高靈敏度、高特異性的人組織激肽釋放酶含量測定ELISA試劑盒，需要制備特異性強，效價高并可以大量生產的抗人組織激肽釋放酶的抗體。本發明利用表位設計軟件設計了一段位于KLK1尾端的特異性12肽序列并采用單抗制備技術制備了高效價、高特異性并方便大量生產的抗人組織激肽釋放酶的單克隆抗體。此抗體為針對KLK1的一段特異性表位的單克隆抗體，國內外均無針對此表位的單克隆抗體，為研制高效性的人組織激肽釋?放酶含量檢測的ELISA試劑盒打下了堅實基礎。?

發明內容

本發明的目的是提供一種特異性強、效價高、只針對一段特異性表位并可大量生產抗人組織激肽釋放酶的單克隆抗體。?

本發明的另一目的是提供一種抗人組織激肽釋放酶的單克隆抗體的制備方法。?

本發明的再一目的是提供一種抗人組織激肽釋放酶的單克隆抗體在制備人組織激肽釋放酶含量檢測的ELISA試劑盒中的應用。?

本發明的還一目的是提供一種分泌特異性抗人組織激肽釋放酶的單克隆抗體的雜交瘤細胞株HTK。?

本發明所述的抗人組織激肽釋放酶的單克隆抗體，由小鼠雜交瘤細胞株HTKCCTCC-200928產生的。?

本發明所述抗體是針對人組織及肽釋放酶尾端的一段12肽的特異性單克隆抗體細胞株；?

是由雜交瘤細胞株HTK在小鼠體內誘生腹水并純化而成的；?

具有較高的親和力，較強的特異性；?

可用于Western?bloing及ELISA試劑盒的制備；?

其采用的多肽序列：NH2-Cys-Lys-Trp-Ile-Glu-Asp-Thr-Ile-Ala-Glu-Asn-Ser-COOH。?

本發明所述的抗人組織激肽釋放酶單克隆抗體方法，其特征在于包括如下步驟：?

1)將人工合成的人組織激肽釋放酶尾端的12肽分別與KLH和BSA交聯作為免疫原和包被原；?

2)免疫小鼠；?

3)篩選出血清效價最高的小鼠；?

4)取脾與骨髓瘤細胞融合得到雜交瘤細胞株；?

5)篩選出雜交瘤細胞株HTK；?

6)擴大培養雜交瘤細胞，并將其注入小鼠腹腔內誘生腹水；?

7)純化腹水后即為抗人組織激肽釋放酶單克隆抗體。?

本發明所述的雜交瘤細胞株HTK?CCTCCNO：C200928，已于2009年4月27日保藏在中國武漢武漢大學中國典型培養物保藏中心(CCTCC)。?

本發明所利用的合成肽為人組織激肽釋放酶尾端的一段由12個氨基酸組成的多肽，其本身不具有抗原性，只具有免疫原性，不能直接刺激動物產生抗體，必須與大分子蛋白偶聯制備成人工抗原，才能刺激機體產生特異性抗體。?

本發明所述的抗人組織激肽釋放酶單克隆抗體的制備方法，包括如下步驟：先將合成肽分別與血藍蛋白(KLH)和牛血清白蛋白偶聯制備免疫原(12P-KLH)和包被原(12P-BSA)，然后通過小鼠免疫，細胞融合，篩選出雜交瘤細胞株，再進行培養，純化成單克隆抗體。?

其中，本發明所述的免疫原，是采用戊二醛交聯法將合成肽(12P)和載體雪藍蛋白(KLH)偶聯成的。用該免疫原免疫Blab/c小鼠，小鼠血清效價能達到1∶25，600。?

所述的人組織及肽釋放酶包被原，是用戊二醛法將合成肽(12P)和牛血清白蛋白(BSA)偶聯而成的。?