[發明專利]5千億活芽胞/克枯草芽胞桿菌原粉活芽胞數的檢測方法

有效

• 申請號: 200910062965.2
• 申請日: 2009-07-03
• 公開（公告）號: CN101586144A
• 公開（公告）日: 2009-11-25
• 發明（設計）人: 陳振民;李青;劉華梅;楊克華;余娜;劉荷梅;程治國;王巧梅;黃志遠;謝翔;陳又香;繆華軍
• 申請（專利權）人: 武漢科諾生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/06
• 分類號: C12Q1/06;C12R1/125;C12R1/07
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發明涉及5,000億活芽胞/克枯草芽胞桿菌原粉活芽胞數含量生物檢測技 術領域，更具體涉及一種5,000億活芽胞/克枯草芽胞桿菌原粉活芽胞數的檢測方 法。

背景技術

20世紀50年代以來，抗生素作為疾病治療劑和動物生長促進劑對畜禽、水 產養殖業發展發揮了重大作用。然而，由于抗生素負面效果越來越嚴重，世界衛 生組織已禁止在飼料中使用任何抗菌藥物，飼料和養殖業以添加抗生素預防和促 進動物生長的飼養方式已經受到了很大沖擊，抗生素替代品的開發和推廣使用成 為世界性的重要課題，其中的益生菌受到廣泛關注。

益生菌又稱微生態制劑，是指有益微生物經過特殊馴化和加工制成的活菌制 劑，益生菌可以改善動物腸道中微生物的菌群平衡，防治某些細菌性疾病的發生， 能提高動物的飼料利用率、提高機體免疫力，促進生長和改善生產性能，得到安 全無藥物殘留的產品。現已開發成商品制劑的益生菌有：芽胞桿菌類、酵母、乳 酸菌、雙歧桿菌、鏈球菌、曲霉等，枯草芽胞桿菌(Bacillus?subtillus簡稱Bs) 是最重要的品種。

與食用益生菌一樣，飼用益生菌制造業十分年輕。為規范益生菌產業健康有 序發展，美國FDA正式規定42種微生物可用作益生菌，其中屬于芽胞桿菌的有 枯草芽胞桿菌、凝結芽胞桿菌、遲緩芽胞桿菌、地衣芽胞桿菌和短小芽胞桿菌， 枯草芽胞桿菌名列首位。中國農業部公布用于飼料的微生物添加劑的有12種： 干酪乳桿菌、植物乳桿菌、糞鏈球菌、屎鏈球菌、乳酸片球菌、枯草芽胞桿菌、 納豆芽胞桿菌、嗜酸乳桿菌、乳鏈球菌、啤酒酵母、產酛假絲酵母、沼澤紅假單 胞菌等，枯草芽胞桿菌也榜上有名。

據全球產業分析公司(GIA)發表的《益生菌：全球戰略經營報告》，預計 到2010年，全球益生菌市場的銷售規模(包括醫用、食品和飼用)將達到200 億美元。另一市場調研機構BCC公司發布的市場研究報告《益生菌市場：原料、 補充劑及食品》顯示：2007年，全球益生菌原料、補充劑及食品的市場規模達 到149億美元，到2013年將達到196億美元，年均復合增長率(CAGR)為4.3％， 兩份權威調研報告的結論頗為相近。

我國至今沒有飼用益生菌銷售的官方統計數字，但“山寨版”Bs產品充斥 市場，產品純度低，價格混亂的現象比比皆是，盡管如此，Bs制劑帶來的效果， 如提高機體免疫力，提高飼料利用率、加快動物生長速率等經濟效果還是得到廣 大用戶的認同。

國際市場需要包括Bs的益生菌高端產品，國內隨著需求量的增加需要安全、 規范的益生菌中低端產品。在這種背景下，科諾公司進入益生菌制造行業。為了 提高競爭力，我們利用響應面方法對枯草芽胞桿菌發酵培養基進行篩選，得到一 個發酵水平最佳的配方，再進行發酵過程控制的研究，發酵水平大幅度提高。發 酵液水平達到200億cfu/g，原藥水平達到5,000億cfu/g以上，遠高于國內通常 采用的固體發酵方式生產的枯草桿菌制劑(有效活菌數一般在150億cfu/g左右) 和部分廠家采用液體發酵生產的制劑(芽胞數一般為1000-2000億cfu/g)。

根據聯合國糧農組織(FAO)的規定，益生菌劑應用應該是含有足夠數量的 活微生物制劑，并能有利于宿主的健康。高含量枯草芽孢桿菌制劑功能性、安全 性及其注明產品質量的檢測尤為重要，而衡量產品的質量標準主要是含有活菌數 量及微生物的種類是否與商標一致。益生菌劑含有足夠數量的活菌數，是衡量其 質量的一個重要指標。大量研究證明，含有的活菌數越多，對機體的益生作用越 顯著。常規生物檢測法：取一定量的菌劑與無菌水混合，進行系列稀釋，然后涂 布或傾注平板，通過培養，統計平板上的單菌落數，計算菌劑中的活菌數量。對 于高含量枯草芽胞桿菌原藥芽胞高度粘結與集聚，分散難的問題，常規的生物檢 測方法的檢測結果誤差大，重復性低。

活菌計數技術作為常規的微生物學技術，是衡量細胞生物量和產率的重要手 段，廣泛用于微生物發酵行業。然而，對于高含量枯草芽胞桿菌原藥(5,000億 cfu/g)，由于芽胞的高度粘結與集聚，不易分散，且不同芽胞的熱穩定性和生物 活性也不相同，造成芽胞檢測的困難，因此，如何準確、快速地檢測高含量枯草 芽胞芽胞成為本項目質量控制的關鍵。

發明內容

本發明的目的是在于提供了一種5,000億活芽胞/克枯草芽胞桿菌原粉活芽 胞數的檢測方法，該方法操作簡便，靈敏度高、適合大量樣品的檢測，是測定樣 品含有的活菌數和菌株鑒定的經典方法。