[發明專利]一種可用于艾滋病基因治療的多靶點siRNA重組慢病毒載體

無效

• 申請號: 200910062851.8
• 申請日: 2009-06-26
• 公開（公告）號: CN101654686A
• 公開（公告）日: 2010-02-24
• 發明（設計）人: 郭德銀;柳葉;陳宇;項念
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;A61K48/00;A61P31/18
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發明涉及分子生物學、病毒學和基因治療領域，更具體地涉及可用于艾滋病基因治療的多靶點siRNA重組慢病毒載體的構建。?

背景技術

由艾滋病毒(HIV)感染引起的獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)是全世界面臨的主要健康威脅之一。據2008年11月30日發布的我國衛生部、聯合國艾滋規劃署和世界衛生組織聯合對我國艾滋病疫的評估顯示：截至2007年底，中國現存的艾滋病病毒感染者和病人約70萬人，其中艾滋病病人8.5萬，全人群感染率為0.05％。艾滋病疫情嚴峻，而目前仍然沒用有效的疫苗。盡管目前治療艾滋病的藥物(如“雞尾酒”療法HAART)能有效地延長患者生存時間，但因長期用藥引起的抗藥性及嚴重的副反應使得該療法難以繼續進行。因此，艾滋病新的治療方法亟待研發，而基于RNA干擾的基因治療技術給了我們新的希望。?

RNA干擾(RNA?interference，RNAi)現象是生物界近十年以來最令人興奮的發現之一。它是一種序列特異性的轉錄后基因沉默(post-transcriptional?genesilencing，PTGS)的過程。目前，RNAi機制已基本闡明：內源或外源的dsRNA(雙鏈RNA)在細胞質中被Dicer切割成帶2個堿基突出的3’末端的21～23nt的小干擾RNA(siRNA)，后者與RNA誘導的沉默復合體(RNA-induced?silencingcomplex，RISC)結合。siRNA在RISC中被解鏈，其中反義鏈引導RISC靶向與之互補的mRNA，RISC則在互補序列中間切割mRNA，從而抑制靶基因的表達。?

目前，RNAi技術已廣泛應用于抗病毒及腫瘤等疾病防治研究領域。在艾滋病防治方面，一個顯然易見的策略就是用siRNA靶向病毒基因。事實上，艾滋研究者們已經設計出了siRNA靶向HIV-1的編碼序列以及非編碼序列(nef，tat，gag，vif，env，rev，LTR)(Boden?et?al.，2004；Capodici?et?al.，2002；Novina?et?al.，2002；Han?et?al.，2004；Jacque?et?al.，2002；Lee?et?al.，2002；Novina?et?al.，2002)。然而，這種干擾方法只是在短期有效。由于HIV突變率高，能改變病毒RNA二級結構，能編碼RNAi阻遏物，以上能力使之能逃選RNAi的抑制作用，這使得RNAi在長期?抑制HIV復制方面變得困難(Das?et?al.，2004；Westerhout?et?al.，2005)。為解決這一難題，我們可以設計出針對某一個病毒基因不同區域的多種siRNA，用這復合的siRNA去干擾病毒基因，可以有效延緩病毒逃逸的出現，這是因為病毒不可能同時改變多個序列而仍然保持其復制能力(Brake?et?al.，2008)。另一種防止病毒逃逸的策略是用siRNA干擾病毒完成其復制所必須的相關宿主蛋白，而干擾該蛋白不應影響細胞正常功能。目前，符合這一要求的最理想的宿主靶點是作為HIV輔助受體之一的CCR5。有證據表明，CCR5對人體的正常生長、分化及免疫功能并不是必需的。在歐美大約1％的人群天然缺失CCR5蛋白，而以上人群對HIV有著顯著的防御力。?

基于以上背景，本發明選擇了設計多種siRNA同時干擾HIV保守基因及宿主蛋白CCR5的策略，構建siRNA重組慢病毒載體，以獲得干擾的疊加效應、長效抑制以及延緩病毒逃逸的效果?；诼《据d體的艾滋病基因治療的研究，在國際上已有研究進入了臨床I/II期階段，其中一命名為“OZ1”的艾滋病基因治療試驗在臨床II期取得了較大成功(Mitsuyasu?et?al.，2009)。這項研究表明艾滋病基因治療是取代藥物治療的可行方式，患者可能無需依賴于長期的藥物治療。基因治代表了一種新的、具有潛力的、長期有效的疾病控制方式，無疑為艾滋病治療開辟了新的途徑。與此相比，國內在此研究領域差距甚遠，這一方面說明，基因治療在艾滋病治療領域的應用是一個明顯的趨勢；另一方面也顯示了在國內填補這一領域的空白的必要性和緊迫性。本發明正是為填補這一空白，為后續研究提供基礎，在我國艾滋病基因治療領域將可能發揮重要作用。?

發明內容

本發明的目的是在于提供了一種可用于艾滋病基因治療的多靶點siRNA重組慢病毒載體，該載體相比于單靶點siRNA重組慢病毒載體具有更高效率的抑制艾滋病毒復制的能力，能克服或延緩病毒逃逸，且適合于艾滋病基因治療。?