[發明專利]miR164基因控制水稻根系發育和育性的功能及應用

有效

• 申請號: 200910062045.0
• 申請日: 2009-05-13
• 公開（公告）號: CN101544987A
• 公開（公告）日: 2009-09-30
• 發明（設計）人: 熊立仲;謝卡斌;侯昕
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/11
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發明涉及水稻基因工程技術領域。具體涉及分離、克隆和通過功能驗證得到一種能夠影響植物根系發育和育性的microRNA(miRNA)及其前體在水稻遺傳改良中的應用。所述的miRNA調控植物的根系發育和生長以及花器官的育性。將該miRNA的前體與泛素蛋白的啟動子(Ubiquitin?promoter)結合后直接轉入水稻，轉基因水稻植株根系發育顯著增強，植株變得不育性；而外施激素可以使轉基因植株的育性得到部分恢復。利用這一技術可以培育根系發達的不育系或保持系從而方便地用于雜交水稻的培育。

背景技術

miRNA是真核生物中存在的、由自身基因組編碼的、長為20-22nt(nucleotide)的small?RNA分子。miRNA主要通過與靶基因的RNA分子互補配對來識別靶基因，然后通過miRNA-RISC(RNA?induced?silencecomplex)來抑制靶基因的表達(Jones-Rhoades?M?W，Bartel?D?P，Bartel?B.MicroRNAs?and?their?regulatoryroles?in?plants.Annual?Review?of?Plant?Biology，2006，57：19-53)。miRNA基因的轉錄本(pre-miRNA)與普通mRNA的結構一致，具有5’-CAP和3’poly(A)等結構。因此pre-miRNA也能通過常規的cDNA文庫來克隆到。一般miRNA的轉錄本不含蛋白編碼區，會有幾個很小的ORF存在于pre-miRNA分子上，但目前沒有發現任何可翻譯出蛋白的pre-miRNA分子。形成miRNA所需的pre-miRNA就位于miRNA基因的轉錄本上，長度在60nt到200nt，少數在200nt以上。Pre-miRNA能形成穩定的foldback的二級結構，被miRNA成熟所需的酶識別。miRNA在植物的生長發育中起著非常重要的調節作用，涉及到植物生長、發育、生物脅迫與非生物脅迫的各個方面。很多miRNA的靶基因是轉錄因子家族。同一個miRNA往往抑制多個靶基因的功能，同時調節植物生長發育中相互聯系的不同過程。例如超表達miR156能使擬南芥的葉片數目增加上百倍，植株干重增加4倍，開花時間延遲(Wu?G，Poethig?R?S.Temporal?regulation?of?shoot?development?in?Arabidopsisthaliana?by?miR156?and?its?target?SPL3.Development，2006，133：3539-3547)；在玉米中，miR172除了調節開花時間以外還調節花的器官的雌雄分化(Chuck?G，Meeley?R，Irish?E，Sakai?H，Hake?S.The?maizetasselseed4?microRNA?controls?sex?determination?and?meristem?cell?fate?by?targetingTasselseed6/indeterminate?spikelet1.Nat?Genet，2007，39：1517-1521)；miR159在ABA應答、種子萌發、花的發育和葉片的形狀等過程中有重要的調節作用，miR159超表達后，在萌發期植株對脫落酸(ABA)的敏感性下降，開花時間延遲，花藥育性降低(Reyes?J?L，Chua?N?H.ABA?induction?of?miR159?controlstranscript?levels?of?two?MYB?factors?during?Arabidopsis?seed?germination.Plant?J，2007，49：592-606)。

水稻作為最重要的糧食作物，改變植株的形態、育性、開花時間對水稻的產量具有重要意義。miRNA是植物生長發育的一個關鍵調節因素，miRNA特別是部分高度保守的miRNA往往能夠改變植物的許多關鍵性狀。植物根系的發育狀況對于植物吸收營養和水分至關重要，發達的根系可以提高植物的營養和水分吸收，提高植物的抗逆性。對植物育性的控制，在利用雜種優勢的雜交作物品種的培育過程中具有非常重要的意義和應用價值。

發明內容

本發明的目的是從水稻中分離克隆一個包含miRNA的DNA片段(在本發明中所述“DNA片段”與“核苷酸序列”同義，下同)，利用這個miRNA分子來控制水稻根的數目和育性。對這個RNA分子進行分析表明它與植物的miRNA164相同，因此被命名為miR164基因。