[發明專利]一種快速檢測三聚氰胺(Melamine)含量的ELISA試劑盒及其方法

無效

• 申請號: 200910061638.5
• 申請日: 2009-04-17
• 公開（公告）號: CN101565464A
• 公開（公告）日: 2009-10-28
• 發明（設計）人: 華權高
• 申請（專利權）人: 武漢華美生物工程有限公司
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C07K14/77;C07K16/44;G01N33/566;G01N33/543;G01N33/545;G01N33/548;G01N33/577
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技術領域

本發明涉及食品安全檢測，特別是涉及小分子的抗原、抗體制備及其檢測方法的建立。本發明具體涉及通過阻斷ELISA檢測樣品中三聚氰胺含量的方法及基于該方法的ELISA試劑盒的制備。

背景技術

小分子化合物，在組織化學上被稱為半抗原，僅具有與相應抗原或致敏淋巴細胞的免疫反應性，而無免疫原性。對于半抗原的檢測一般采用氣相色譜、高壓液相色譜、質譜等手段，但是免疫學檢測方法在半抗原的檢測上逐漸顯示出其不可替代的優勢。免疫學檢測法不像傳統的色譜和質譜等方法那樣需要復雜、昂貴的設備，此外還具有易操作，前處理過程簡單，成本低，檢測快速、準確、靈敏，可實現高通量、自動化檢測等優點，因此具有極為廣泛的應用前景。

由于小分子化合物不具有免疫原性，所以小分子化合物的免疫學檢測方法中至關重要的一步就是如何設計合成同時具有免疫原性和反應原性的小分子載體偶聯物。通常將小分子化合物與分子量比較大的載體蛋白偶聯制備完全抗原(免疫原)，借助載體蛋白的T細胞表位獲得免疫原性，以刺激機體產生抗體。制備完全抗原時常用的載體有牛血清白蛋白(BSA)、鑰孔血藍蛋白(KLH)、兔血清白蛋白(RSA)、雞卵清蛋白(OVA)、人血清白蛋白(HSA)、多聚賴氨酸(PLL)等。

本發明中的三聚氰胺(Melamine)(化學式：C₃H₆N₆)，俗稱密胺、蛋白精，IUPAC命名為[1，3，5-三嗪-2，4，6-三氨基]，是一種三嗪類含氮雜環有機化合物，被用作化工原料。它是白色單斜晶體，幾乎無味，微溶于水(3.1g/L常溫)，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、熱乙二醇、甘油、吡啶等，對身體有害，不可用于食品加工或食品添加物。

食品工業中常常需要測定食品的蛋白質含量，由于直接測量蛋白質技術上比較復雜，所以常用一種叫做凱氏定氮法的方法，通過測定氮原子的含量來間接推算食品中蛋白質的含量。由于三聚氰胺(含氮量66％)與蛋白質(平均含氮量16％)相比含有更高比例的氮原子，所以被一些造假者利用，添加在食品中以造成食品蛋白質含量較高的假象，從而造成諸如2007年美國寵物食品污染事件和2008年中國毒奶粉事件等嚴重的食物安全事故。

中國國家食品質量監督檢測中心在2008年9月13日指出，三聚氰胺屬于化工原料，是不允許添加到食品中的，故暫未設定像農藥般的殘留標準限制。10月8日，衛生部、工業和信息化部、農業部、國家工商行政管理總局和國家質量監督檢驗檢疫總局聯合發布公告，制定三聚氰胺在乳與乳制品中的臨時管理值：嬰幼兒配方乳粉中三聚氰胺的限量值為1mg/kg，高于限量值的產品一律不得銷售。液態奶(包括原料乳)、奶粉、其它配方乳粉中三聚氰胺的限量值為2.5mg/kg，高于限量值的產品一律不得銷售。含乳15％以上的其它食品中三聚氰胺的限量值為2.5mg/kg，高于限量值的產品一律不得銷售。有鑒于此，三聚氰胺含量檢測成為目前國內食品安全檢測的焦點。

三聚氰胺屬于小分子化合物，與其他很多小分子化合物一樣，一般采用GC、MS、LC-UV法、高效液相色譜法等測定三聚氰胺含量，相關檢測機構建立的方法也少有報道。農業部標準NY/T?1372-2007中建立的飼料中三聚氰胺的測定方法是HPLC法和GC-MS法。最近國家質檢總局與國家標準化管理委員會聯合發布的《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》(GB/T?22388-2008)中也是采用HPLC法、LC-MS/MS法、GC-MS和GC-MS/MS法。但以上方法存在過程冗長、需要衍生、試劑用量較大及靈敏度低等缺點。

目前三聚氰胺免疫學檢測方法也有報道，但是市面上能夠有效檢測三聚氰胺的試劑盒不多。本專利根據三聚氰胺小分子化合物的特點，設計抗原，制備特異性抗體，研制出的檢測三聚氰胺的阻斷酶聯免疫(ELISA)試劑盒，能快速、特異性的檢測出樣品中的三聚氰胺，根據試劑盒內說明書操作能計算出三聚氰胺的含量；是一種高效、快速、經濟的高科技產品。

發明內容

本發明的目的是提供一種小分子抗原及抗體制備方法，利用酶聯免疫吸附原理，建立一種能快速、特異性檢測出樣品中小分子物質(三聚氰胺)含量的ELISA方法。

所述小分子抗原制備方法指：將無免疫原性或弱免疫原性小分子(三聚氰胺)偶聯到特殊載體上，使其同時具有免疫原性和反應原性。