[發(fā)明專利]一種快速檢測水稻種子純度和真?zhèn)蔚蔫b定方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910061545.2
• 申請日: 2009-04-10
• 公開（公告）號: CN101586163A
• 公開（公告）日: 2009-11-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李姝婧;謝紅衛(wèi);李紹清;朱英國
• 申請（專利權(quán)）人: 武漢大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所
• 代理人: 王敏鋒

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種利用分子標(biāo)記檢測技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種快速定性快速分析大樣品水稻種子的純度、鑒定假冒偽劣品種和構(gòu)建多品種的特異性指紋圖譜的方法，該方法還適用于分子標(biāo)記輔助選擇育種，同時可以將SCAR標(biāo)記作為探針，篩選基因組文庫，應(yīng)用于圖位克隆構(gòu)建重疊群。?

背景技術(shù)

水稻是我國的第一大糧食作物，尤其雜交稻占水稻播種總面積的60％左右，播種面積大、種子銷售利潤高，在我國糧食生產(chǎn)中占有十分重要地位。在水稻品種繁殖、雜交水稻制種過程中不育系或恢復(fù)系育性不穩(wěn)、機(jī)械混雜、生物學(xué)混雜等都會降低種子純度，影響水稻產(chǎn)量，給生產(chǎn)者和經(jīng)營者帶來較大的商業(yè)風(fēng)險。此外，人為造假導(dǎo)致的坑農(nóng)事件曾經(jīng)給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大損失。為了確保生產(chǎn)用種安全，常規(guī)的種子純度鑒定方法是赴海南加代種植，進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。這種方法不僅受生長季節(jié)和環(huán)境的限制，而且鑒定周期長，費(fèi)時費(fèi)工，不利于種子鑒定的商品化運(yùn)作和司法舉證。因此，開發(fā)不受環(huán)境影響、快捷經(jīng)濟(jì)、可靠的種子指紋鑒定技術(shù)就顯得十分必要。我國加入WTO和UPOV組織后，一個新品種的推廣、產(chǎn)權(quán)保護(hù)都必須提供該品種的特異鑒定標(biāo)記和DNA指紋，從這個意義上講，建立品種特異性標(biāo)記指紋也勢在必行。?

品種指紋包括蛋白質(zhì)指紋和DNA指紋兩類。蛋白質(zhì)指紋是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一項(xiàng)種子鑒定技術(shù)，包括種子貯藏蛋白、同工酶和等位酶鑒定等，是利用不同品種在蛋白質(zhì)組成成分上的差異來反映作物遺傳組成的不同。小麥、大麥醇溶蛋白PAGE，豌豆、黑麥草種子蛋白PAGE，雜交玉米醇溶蛋白等電聚焦電泳等已成為國際種子檢測協(xié)會(ISTA)的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)技術(shù)。DNA指紋是近年來隨著分子標(biāo)記的發(fā)展而建立起來、直接檢測不同品種間基因組DNA序列多態(tài)性的品種鑒定技術(shù)。在過去20年中，隨著基因組計(jì)劃研究的不斷深入，DNA分子標(biāo)記得到了迅速發(fā)展并被廣泛用于分子生物學(xué)研究的各個領(lǐng)域。已經(jīng)發(fā)展起來的分子標(biāo)記多達(dá)60多種，如以傳統(tǒng)的Southern雜交為基礎(chǔ)的RFLP、SSCP、RFLP、?DGGE-RFLP分子標(biāo)記，以PCR為基礎(chǔ)的RAPD、STS、EST、SCAR、RP-PCR、AS-PCR、SSCP-PCR標(biāo)記，以基因組序列為基礎(chǔ)的SNP、InDel、cSSR標(biāo)記等，這些標(biāo)記無疑為各種植物(品種)DNA指紋鑒定提供了堅(jiān)實(shí)的技術(shù)基礎(chǔ)。?

李云海等(1999，2000)曾利用RAPD和SSR技術(shù)分別分析了具有多種質(zhì)源和較大應(yīng)用面積的24個水稻胞質(zhì)雄性不育系、1個光(溫)敏核不育系、3個保持系和5個生產(chǎn)中應(yīng)用較廣的恢復(fù)系。平均每個RAPD引物具有3.4條多態(tài)性片斷，每對SSR引物可檢測到5.1個等位基因。聚類分析表明，生產(chǎn)上主要應(yīng)用的不育系遺傳背景單一。唐梅等(2000，2002)用RAPD標(biāo)記檢測16個雜交水稻骨干保持系，從250個引物中篩選出10個引物，擴(kuò)增出84條帶。品種間多態(tài)性頻率為72.6％，遺傳距離在0.0526～0.2152之間，69％的保持系聚為一類；用4對AFLP引物組合對10個恢復(fù)系，5個不育系進(jìn)行了AFLP多態(tài)性分析。共擴(kuò)出165條多態(tài)性帶，多態(tài)性為66.43％，但親本間遺傳距離小。段世華等(2001，2002)應(yīng)用RAPD和SSR標(biāo)記分析了我國雜交水稻35個主要恢復(fù)系的多態(tài)性。從258個RAPD引物中篩選出13個，檢測出多態(tài)性片段93條，但是大部分材料的遺傳相似系數(shù)在0.80以上；25對SSR引物檢測到65個等位基因，平均每對引物檢測到2.6個等位基因，但遺傳差異小。近年來許多研究者嘗試?yán)梅肿訕?biāo)記進(jìn)行雜交組合及親本的區(qū)別鑒定，并取得了一些進(jìn)展。研究表明，利用多條分子標(biāo)記可以區(qū)分某些組合及其親本。李莉等(2000)對協(xié)優(yōu)63、64及其親本進(jìn)行RAPD和SSR分析，篩選出9個隨機(jī)引物和13對SSR引物分別可以在供試的水稻組合與親本之間，以及雜交組合之間進(jìn)行區(qū)別和鑒定。向太和等(2000)篩選出8個隨機(jī)引物，穩(wěn)定擴(kuò)增出的12個強(qiáng)的多態(tài)性標(biāo)記能夠有效地區(qū)別汕優(yōu)63、汕優(yōu)64和汕優(yōu)晚3及其親本。毛加寧等(2002)篩選出6個引物，擴(kuò)增出20個強(qiáng)多態(tài)性標(biāo)記，能有效地區(qū)分紅蓮2號、汕優(yōu)63、馬協(xié)63三組三系雜交水稻中不育系、保持系、恢復(fù)系和F1。?