[發明專利]日本沼蝦呼腸孤病毒基因診斷試劑盒

無效

• 申請號: 200910061434.1
• 申請日: 2009-04-07
• 公開（公告）號: CN101509044A
• 公開（公告）日: 2009-08-19
• 發明（設計）人: 張叔勇;周麗榮
• 申請（專利權）人: 中國科學院武漢病毒研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所
• 代理人: 黃瑞棠

技術領域

本發明涉及一種病毒基因診斷試劑盒，尤其涉及一種日本沼蝦呼腸孤病毒基因診斷試劑盒。

背景技術

河蝦(Macrobrachium?nipponensede?Haan)，又名青蝦，學名為日本沼蝦，為日本和我國所特有淡水蝦類。它營養豐富，肉嫩味美，是一種深受人們喜愛的名貴水產品。在研究河蝦病害的過程中，從湖北省某養殖場分離到一株呼腸孤病毒(命名為MnRV，Macrobrachium?nipponensede?Reovirus)。目前對病毒病尚無治療辦法。因此，建立靈敏準確的早期檢測技術對于預防疾病，減少經濟損失具有重要意義。目前沒有關于此種病毒檢測技術的專利和報道。

發明內容

本發明的目的是填補現有技術的空白，提供一種日本沼蝦呼腸孤病毒基因診斷試劑盒。

本發明的目的是這樣實現的：

根據日本沼蝦呼腸孤病毒的基因組序列設計一對特異性引物，采用RT-PCR的方法，可以對日本沼蝦是否感染呼腸孤病毒進行檢測。

1、一種日本沼蝦呼腸孤病毒基因診斷試劑盒(簡稱本試劑盒)

試劑A：組織勻漿緩沖液，為Tris-NaCl-EDTA緩沖液；

試劑B：RNA提取液，為Trizol液；

試劑C：日本沼蝦呼腸孤病毒RNA反轉錄反應液，其中含有特定引物MnRV-325R，其序列為：5′-TCGTAAGGTGTAGGTTGTGAT-3′；

試劑D：PCR反應液，其中含有特定引物MnRV?325R及MnRV?325F，其序列為：

MnRV-325R?5′-TCGTAAGGTGTAGGTTGTGAT-3′；

MnRV-325F?5′-CAAACGAATTAAATGATGATG-3′；

試劑E液：陽性對照，為MnRV陽性DNA模板。

2、本試劑盒的獲得方法

本試劑盒的所有試劑均購自商業化公司。

3、本試劑盒的用途

本試劑盒的用途就在于能檢測出日本沼蝦苗種、蝦、成蝦及親蝦是否攜帶日本沼蝦呼腸孤病毒。

本發明具有下列優點和積極效果：

1、本發明能快速、靈敏、準確地檢測出日本沼蝦苗種、蝦、成蝦及親蝦是否攜帶日本沼蝦呼腸孤病毒；

2、本發明適用于檢測日本沼蝦呼腸孤病毒。

附圖說明

圖1是PCR產物電泳結果圖。

具體實施方式

一、本試劑盒的幾種試劑的組成

1、試劑A液、試劑B液為常用試劑。

2、試劑C液

試劑C液是含有日本沼蝦呼腸孤病毒RNA反轉錄反應液，每管組成為：

4μl?5×RNA反轉錄緩沖液，

2μl?l0mM?MgCl₂，

8μl??RNase?Free?H₂O，

1μl?l0mM?dNTP?Mixture，

lμl?1u?RNsin，

1μl?1u?M-MLV?ReverseTranscriptase，

1μl?10pM?MnRV-325R。

3、試劑D液

試劑D液是PCR反應液，每管組成為：

2mM?MgCl₂，

5μl?10×PCR緩沖液，

41μl?ddH₂O，

2U?Taq酶，

10pM?MnRV-325R及MnRV-325F。

二、本試劑盒的使用方法如下：

①日本沼蝦組織的勻漿

待檢日本沼蝦組織100-200mg加入100μl試劑A在冰上混勻，搗碎勻漿；冰上靜置15分鐘。

②日本沼蝦呼腸孤病毒RNA的提取

在4℃以12000g離心5分鐘；將水相(上層)轉至一個新的1.5ml離心管中；加入1ml試劑B，混勻，冰上靜置15分鐘；加入200μl氯仿，振搖15秒，靜置10分鐘；在4℃以12000g離心15分鐘；將水相(上層)轉至一個新的1.5ml離心管中。

加入500μl異丙醇后-20℃沉淀30分鐘。12000g離心10分鐘；用75％乙醇淋洗RNA沉淀然后離心5分鐘，晾干；用10μl無RNA酶的水溶解，得到日本沼蝦呼腸孤病毒RNA溶液。

③日本沼蝦呼腸孤病毒RNA反轉錄