[發(fā)明專利]一種結(jié)核分枝桿菌全基因組ORF克隆文庫的構(gòu)建方法及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910061066.0
• 申請日: 2009-03-11
• 公開（公告）號: CN101538581A
• 公開（公告）日: 2009-09-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 何正國;王毅
• 申請（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/74;C40B50/06;C12R1/19;C12R1/32
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所
• 代理人: 王敏鋒

1.一種用于構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌H37Rv全基因組ORF克隆文庫的細(xì)菌雙雜交載體pTRG-MCMΔ，其特征在于，它是通過以下步驟獲得的：

1)將購于invitrogen公司的細(xì)菌雙雜交載體pTRG上211位點(diǎn)的XbaI酶切位點(diǎn)消除：先用XbaI對pTRG載體進(jìn)行酶切，再用Klenow片段對酶切后線性載體的5’末端進(jìn)行補(bǔ)平，并將線性載體自連環(huán)化，從而將211位點(diǎn)完整的XbaI酶切位點(diǎn)消除，獲得一個(gè)中間載體pTRG-XbaIΔ；

2)將步驟1)獲得的中間載體pTRG-XbaIΔ用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI進(jìn)行消化；

3)利用極端嗜熱古菌S.solfataricus的微型染色體維持基因MCM作為一個(gè)媒介基因，通過PCR的方法獲得兩末端分別含有EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn)的MCM媒介基因；

4)將步驟3)獲得的MCM媒介基因用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI進(jìn)行消化；

5)將步驟2)獲得的中間載體pTRG-XbaIΔ和步驟4)獲得的MCM媒介基因在16℃的條件下連接過夜，得到中間載體pTRG-MCM；

6)將步驟5)獲得的中間載體pTRG-MCM用限制性內(nèi)切酶BamHI充分酶切；

7)將步驟6)酶切后的中間載體pTRG-MCM末端削平并自連接，獲得改造的細(xì)菌雙雜交載體pTRG-MCMΔ，其大小為5592bp，它的核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO：1所示。

其中，步驟3)利用PCR擴(kuò)增的MCM基因的引物對的序列如下所示：

正向引物：GAGCGAATTCGTTGGAAATTCCTAGTAAAC；

反向引物：GGATGGCTCGAGTCTAGACTAGACTTTTTTGTAACAT。

2.一種構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌H37Rv全基因組ORF克隆文庫的方法，其特征在于步驟如下：

1)利用PCR方法獲得結(jié)核分枝桿菌H37Rv的全部編碼基因：對結(jié)核分枝桿菌H37Rv全部編碼基因內(nèi)部的酶切位點(diǎn)進(jìn)行分析，選擇所有編碼基因內(nèi)部沒有的酶切位點(diǎn)作為引物設(shè)計(jì)時(shí)的酶切位點(diǎn)，在設(shè)計(jì)引物時(shí)將所有基因分為六類，前五類基因分別在上游引物和下游引物中引入EcoRI和XbaI、NotI和XbaI、EcoRI和XhoI、NotI和XhoI、BamHI和XhoI，第六類采用連接頭的方法在接頭內(nèi)引入EcoRI酶切位點(diǎn)，在下游引物內(nèi)引入XbaI酶切位點(diǎn)，利用PCR對全部編碼基因進(jìn)行擴(kuò)增，利用這種引物設(shè)計(jì)的PCR方法擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌H37Rv全部編碼基因；

2)將分為六類的基因擴(kuò)增產(chǎn)物混合，分別與相對應(yīng)的酶切組合制備的pTRG-MCMΔ載體連接，將連接產(chǎn)物脫鹽后電轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH10B，獲得重組克隆，將含有重組克隆的大腸桿菌混合培養(yǎng)，得到重組質(zhì)粒。