[發明專利]魔芋軟腐病病原菌分子快速檢測的方法

無效

• 申請號: 200910060981.8
• 申請日: 2009-03-06
• 公開（公告）號: CN101509042A
• 公開（公告）日: 2009-08-19
• 發明（設計）人: 顧玉成;吳金平;刁英;胡中立
• 申請（專利權）人: 湖北省農業科學院經濟作物研究所;武漢大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64;G01N21/31;C12R1/01
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所
• 代理人: 王敏鋒

1、一種魔芋軟腐病病原菌分子快速檢測的方法，其步驟是：

A、細菌的培養：取凍存魔芋軟腐病病原菌和致病菌擴大培養，劃線后挑取單菌落接種于營養肉湯培養基，27-30℃培養過夜后挑取單菌落接種于NB培養基中，27-30℃搖床培養過夜后待用；

B、獲得魔芋軟腐病病原菌基因序列：用細菌基因組DNA提取試劑盒提取魔芋軟腐病病原菌基因組，用細菌通用引物：P1：5’-AGA?CTT?TGA?TCC?TGGCTC?AG-3’，P2：5’-CGG?CTA?CCT?TGT?TAC?GAC?TTC-3’進行PCR擴增，反應體系為25μl：10mMol的三磷酸堿基脫氧核苷酸2μl，20mMol的氯化鎂2μl，pH8.3-8.8緩沖液2.5μl，蒸餾水16μl，加10μM的引物P1和P2各0.5μl，2u/μl的Taq酶1μl，模板0.5μl，反應條件是：95℃?3min；95℃?30s，50℃?30s，72℃?1.5min，循環35次；72℃?10min，PCR產物以1％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，檢測到1500bp的條帶，將軟腐病病原菌基因組PCR擴增產物回收，回收片段與克隆載體pGEM-T連接，然后轉化至大腸桿菌DH-5a感受態細胞，進行藍白斑篩選，選取陽性菌落擴大培養后，菌液用M13：5′-GCC?AGG?GTT?TTC?CCA?GTC?ACGA-3′，5′-GAG?CGG?ATAACAATT?TCA?CAC?AGG-3′進行PCR擴增，凝膠電泳檢測，將檢測后確認含有目的片段的陽性克隆，獲得軟腐病病原菌基因序列；

C、熒光定量PCR特異引物設計：根據基因庫中歐文氏桿菌公布的16S?rDNA基因序列以及分離測序所得的魔芋軟腐病病原菌基因序列與致病菌的差異，使用Primer5軟件設計熒光定量PCR特異引物F：5′-ATG?CAA?CGC?GAA?GAT?CCTTAG?GTAC-3′，R：5′-CATTGAAGC?ACG?TGTCTAGCC?CTAC-3′，該引物擴增的目的片段長度為228bp；

D、引物特異性檢測：細菌基因組DNA提取試劑盒提取的魔芋軟腐病病原菌基因組DNA和致病菌的基因組DNA進行F、R引物特異性檢測，PCR反應體系為25μl：10mMol的三磷酸堿基脫氧核苷酸2μl，20mMol的氯化鎂2μl，pH8.3-8.8緩沖液2.5μl，蒸餾水16μl，加10μM的引物F和R各0.5μl，2u/μl的Taq酶1μl，模板0.5μl，反應條件是：95℃預變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，循環35次，PCR產物以1％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，檢測設計引物的特異性；

E、確定熒光定量PCR檢測魔芋軟腐病病原菌的標準曲線：將軟腐病病原菌PCR擴增產物回收，回收片段與克隆載體pGEM-T連接，然后轉化至大腸桿菌DH-5a感受態細胞，進行藍白斑篩選，選取陽性菌落擴大培養后，菌液用M13：5′-GCC?AGG?GTT?TTC?CCA?GTC?ACG?A-3′，5′-GAG?CGG?ATA?ACA?ATT?TCACAC?AGG-3′引物進行PCR擴增，凝膠電泳檢測，并將檢測后確認含有目的片段的陽性克隆并進行DNA序列測定，測序結果與已知序列比對正確后，用質粒提取試劑盒提取質粒，將質粒10倍梯度稀釋溶液分別作為熒光定量PCR反應模板，確定熒光定量PCR檢測魔芋軟腐病病原菌的標準曲線；

F、確定熒光定量PCR檢測魔芋軟腐病病原菌靈敏度：用分光光度計測量菌液濃度，將菌液濃度為10⁸CFU/ml依次10倍稀釋，并取90ml涂平皿，10³CFU/ml有33個菌落，10⁴CFU/ml有328個菌落，10⁵CFU/ml菌落無法計數，以10⁷CFU/ml-10²CFU/ml的6個稀釋梯度進行熒光定量PCR檢測，熒光定量PCR反應，確定熒光定量PCR檢測魔芋軟腐病病原菌的標準曲線；

G、熒光定量PCR的應用：將有軟腐病癥狀的魔芋在吐溫-20中浸泡過夜，浸泡液在16000r/min，4℃條件下離心20min，沉淀用10μL無菌水溶解，取1μL作為模板用熒光定量PCR標準曲線對其進行定量分析，應用于生產。