[發明專利]豬免疫力相關分子標記克隆及應用

無效

• 申請號: 200910060794.X
• 申請日: 2009-02-19
• 公開（公告）號: CN101487054A
• 公開（公告）日: 2009-07-22
• 發明（設計）人: 趙書紅;劉向東;余梅;李新云;朱猛進;李長春;曹建華;李世軍
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12P19/34
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發明屬于家畜基因工程技術領域，具體涉及一種作為豬標記輔助選擇應用的與豬免疫力相關的分子標記的克隆及應用。

背景技術

我國是世界上養豬生產和豬肉消費第一大國，養豬業已經是農村支柱產業之一，家畜的疾病是畜牧生產的大敵，由于疾病造成的經濟損失約占畜牧業產值的12％～15％，實際情況還要嚴重。濫用抗生素導致出口豬肉藥物殘留的尷尬，先進的疫苗還是抵擋不住周期性豬病的爆發。同時，國內外對豬肉消費提出了新的要求，如“綠色豬”“環保豬”等，這些新問題給豬的雨中育種工作提出了新的要求。近年來，現代育種技術在改良豬生產性狀方面做出了很大貢獻，但對健康和抵抗疾病的能力的遺傳改良還很有限。因此，迫切需要從遺傳學的角度來提高豬的抗病性，同現有的措施相配合來解決這些問題。

采用分子遺傳學方法從本質上提高豬自身抗病能力的核心是提高豬的免疫力。免疫力是衡量動物健康水平的重要指標，它屬于數量性狀，受到多基因的調控，分子機制非常復雜，對豬免疫力及其分子機制的解析是畜牧領域的一個研究熱點，而旨在提高豬免疫力的育種工作也被稱作抗病育種。在抗病育種工作過程中免疫相關的重要基因的克隆和相關分子標記的開發與應用又是研究的重中之重。

本發明選取的Cav1基因便是這樣一個在細菌和病毒攻擊宿主過程中發揮至關重要作用的基因之一。Cav1屬于Caveolin家族，編碼Caveolin1蛋白(中譯名窖蛋白)。Caveolin1蛋白是構成脂筏和細胞窖的主要成分，它分布于許多不同類型的細胞中。研究發現該基因參與多種細胞生命活動，如細胞內吞、膽固醇運輸、胞膜形成、信號傳導、腫瘤生成。而在這些生命過程中，Caveolin1都發揮著極為重要的作用，因此對其功能的研究已經成為現在生命科學的一個熱點。

隨著研究的深入，人們發現Caveolin1蛋白還參與多種細菌和病毒性病原體入侵宿主細胞的過程，如HIV-1等病毒和Mycobacteria、E.coli等細菌。國外研究表明HIV21的跨膜糖蛋白gp41有一個保守的Caveolin結合基序(CBD)。值得注意的是，在HIV感染的細胞中，存在一個穩定的gp41與Caveolin1蛋白的復合物，因此抗CBD的抗體可能能夠抑制gp41與窖蛋白的相互作用，利用這一原理可以開發治療艾滋病的疫苗。

不僅如此，Caveolin-1亦在病原體增殖過程中發揮重要作用，Marjomaki等分析了Echovirus1(EV1)在結合到受體后早期感染及其進入宿主細胞的途徑。EV1結合到宿主細胞表面后，病毒衣殼構象發生變化。該研究發現EV1在細胞核周圍的囊泡結構中存在，電鏡顯示EV1病毒顆粒存在于胞膜窖中。不表達Caveolin1的細胞不能感染EV1，這說明Caveolin1蛋白在EV1病毒復制增殖中是非常重要的。

但是目前國內外對Cav1基因研究主要集中在人類醫學領域，對豬Cav1基因研究較少。而且迄今為止尚沒有利用豬Cav1基因來尋找與豬免疫力相關的分子標記的報道。因此，申請人克隆了與豬免疫力相關Cav1基因的cDNA，利用該cDNA序列進行了多態性和關聯分析等研究，以期得到新的作為豬免疫力相關的分子標記。

發明內容

本發明的目的在于克隆與豬免疫力相關的分子標記，利用該分子標記作為豬標記輔助育種的應用。

本發明通過以下技術方案實現：

申請人克隆得到一種與豬免疫力相關的分子標記，它是序列表SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列。在序列表SEQ?ID?NO：1的第387bp處有1個由G387-C387的堿基突變，導致HaeIII-RFLP多態性；在序列表SEQ?ID?NO：1的第474bp處有1個由A474-G474的堿基突變，導致MbiI-RFLP多態性。在序列表SEQID?NO：1的第512bp處有1個由G512-A512的堿基突變，導致AciI-RFLP多態性。

其中，克隆豬Cav1基因的引物對的DNA序列如下所示：

正向引物：5′AATCTCCTCAGAGCCTTCATCC?3′，反向引物：5′CGCTGTACTGGCAAATTGAAAC?3′。

檢測SEQ?ID?NO：1所述的分子標記(即檢測堿基突變)所用的引物對的DNA序列如下所示：

正向引物：5’-ACTGGTTTTACCGTTTGC-3’，反向引物：5′-GAAACTCGAAATTGGCAC-3′。

申請人建立一種制備上述分子標記和檢測上述分子標記的方法，該方法的步驟如下：