[發(fā)明專利]東北天南星凝集素蛋白編碼序列及其應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910060763.4
• 申請日: 2009-02-16
• 公開（公告）號: CN101649321A
• 公開（公告）日: 2010-02-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙秀云;馬宏宇;祁高富;喻子牛
• 申請（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C07K14/42;C12N15/70;C12P21/02;C07K16/16;A01P7/04;A01P7/00;C12R1/19
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所
• 代理人: 王敏鋒

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種在東北天南星中表達(dá)的凝集素蛋白(東北天南星凝集素蛋白，Arisaema?amuremse?agglutinin，ArA-Lectin)及其核酸序列。本發(fā)明涉及該蛋白的氨基酸和核酸序列的制備方法和用途。?

技術(shù)背景?

植物凝集素是含有至少一個(gè)非催化結(jié)構(gòu)域并能可逆結(jié)合特異單糖或寡糖的一類(糖)蛋白質(zhì)(Peumans和Van?Damme，1995)。它們最大的特點(diǎn)在于其能夠識別糖和糖類，每一種凝集素具有與某一種特殊的碳水化合物專一結(jié)合的能力。另外它們還能選擇性地使不同來源的血紅細(xì)胞發(fā)生凝集，因而又命名為植物血凝素(phytohemagglutinin)。從1888年Herman?Stillmark在蓖麻籽中發(fā)現(xiàn)第1個(gè)凝集素到現(xiàn)在，已發(fā)現(xiàn)了1000多種植物凝集素。由于分離的凝集素越來越多，人們?yōu)榱吮阌谘芯浚瑢λ鼈冞M(jìn)行了歸類(高瑩等，2000)。根據(jù)植物凝集素亞基的結(jié)構(gòu)特征，植物凝集素被分成4種類型：部分凝集素、全凝集素、嵌合凝集素、超凝集素；根據(jù)氨基酸序列的同源性及其在進(jìn)化上的關(guān)系，植物凝集素可以分為7個(gè)家族：豆科凝集素、幾丁質(zhì)結(jié)合凝集素、單子葉甘露糖結(jié)合凝集素、II型核糖體失活凝集素、木菠蘿素家族、葫蘆科韌皮部凝集素、莧科凝集素；根據(jù)凝集素專一識別的糖類的不同，可以分為6個(gè)組別：巖藻糖組、半乳糖/N-乙酰半乳糖胺組、N-乙酰葡萄糖胺組、甘露糖組、唾液酸組、復(fù)合糖組。?

植物凝集素在植物界的分布極其廣泛，不僅對蚜蟲、葉蟬和稻飛虱等同翅目的害蟲有很高抗性效果，同時(shí)對鱗翅目、鞘翅目的害蟲也有一定的效果，并對一些真菌病害有效。眾所周知，同翅目的害蟲不僅寄主范圍廣，除因取食使植物營養(yǎng)不良導(dǎo)致減產(chǎn)外，更嚴(yán)重的是，其取食過程可導(dǎo)致植物感染100多種病害，使作物大幅減產(chǎn)。由于凝集素的這一獨(dú)特抗蟲特性，因此凝集素基因在抗蟲轉(zhuǎn)基因分子育種中具有獨(dú)特的優(yōu)勢和廣闊的應(yīng)用前景(潘科等，2002；趙強(qiáng)等，2005)。?

1982年Hoffman克隆了第一個(gè)凝集素基因，它編碼一個(gè)菜豆凝集素蛋白。現(xiàn)在已有很多凝集素基因被克隆，如p-lectin、WGA、GNA、PTL等。2000年數(shù)據(jù)庫(EMBL)檢索表明人們已克隆了222個(gè)植物凝集素基因，它們大多編碼豆科凝集素和單子葉植物甘露糖結(jié)合凝集素。目前成功地用于植物抗病蟲害基因工程的植物凝集素基因主要有：雪花蓮凝集素基因、豌豆外源凝集素基因、麥胚凝集素基因、莧菜凝集素基因及核糖體失活蛋白基因等。在植物中表達(dá)凝集素要求相對高的水平才具有較好的抗蟲效果，構(gòu)建強(qiáng)的高效表達(dá)載體，采用合適的強(qiáng)啟動子，針對害蟲取食是韌皮部可采用特異性表達(dá)啟動子，或與其它的殺蟲蛋白相結(jié)合提高抗性。具有抗蚜活性的基因應(yīng)用最多的是雪花蓮?fù)庠茨?GNA)基因。目前報(bào)道的轉(zhuǎn)植物凝集素基因的植物有水稻、煙草、馬鈴薯、小麥、番茄等，均表現(xiàn)出對桃蚜、水稻褐飛虱、菜園夜蛾和麥長管蚜等害蟲的抑制和抗性。?

本發(fā)明中，我們在天南星科(Araceae)植物東北天南星(Arisaema?amuremse)中克隆到半夏凝集素(PTA)基因的同源基因東北天南星ArA-Lectin基因。在本發(fā)明被公布之前，尚未有任何公開或報(bào)道過本專利申請中提及的東北天南星凝集素ArA-Lectin蛋白的序列及其核酸序列。?

發(fā)明內(nèi)容?

本發(fā)明的第一個(gè)目的就是提供一種新的基因，即東北天南星凝集素基因(araa)，該基因是一個(gè)編碼東北天南星凝集素(ArA-Lectin)蛋白的基因。?

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種新的凝集素蛋白，該蛋白是東北天南星Ara-Lectin。?

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)上述新的東北天南星Ara-Lectin蛋白和核酸序列的方法。?

本發(fā)明還提供了東北天南星凝集素Ara-Lectin蛋白多肽和編碼序列在防治農(nóng)業(yè)害蟲上的應(yīng)用。?

在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種分離出的DNA分子，該分子包括：編碼具有東北天南星ArA-Lectin蛋白活性的多肽核苷酸序列，所述的核苷酸序列與序列表SEQ?ID?NO：1所示。該序列的開放讀碼框部分(Open?Reading?Frame，ORF)包括780個(gè)堿基，編碼259個(gè)氨基酸。在發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了一種分離出的東北天南星ArA-Lectin蛋白質(zhì)多肽，它包括：具有SEQ?ID?NO.1氨基酸序列的多肽。?

在發(fā)明的另一方面，還提供了一種制備具有東北天南星ArA-Lectin蛋白活性多肽的方法，其步驟如下：?