[發明專利]蘇云金芽胞桿菌殺線蟲晶體蛋白基因cry1518-35及應用

有效

• 申請號: 200910060470.6
• 申請日: 2009-01-09
• 公開（公告）號: CN101492686A
• 公開（公告）日: 2009-07-29
• 發明（設計）人: 孫明;郭素霞;彭東海;王鵬霞;阮麗芳;喻子牛
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/32
• 分類號: C12N15/32;C12N1/21;C12N1/15;C12N1/19;A01H5/00;C07K14/325;A01N63/02;A01P5/00;C12R1/19
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發明屬于農業生物防治和農業微生物基因工程領域。具體涉及一個具有殺線蟲活性的殺蟲晶體蛋白基因的分離、克隆以及它編碼的蛋白在微生物殺蟲劑中的應用。

背景技術

蘇云金芽胞桿菌(Bacillus?thuringiensis，Bt)是一類廣泛存在于土壤中的革蘭氏陽性細菌，在其生長發育過程中，能夠形成內生芽胞，因其伴隨芽胞形成而產生對昆蟲具有特異毒性的殺蟲晶體蛋白(InsecticidalCrystal?Proteins，ICPs)，而有別于分泌腸毒素的蠟狀芽胞桿菌(Bacillus?cereus)和引起炭疽病的炭疽芽胞桿菌(Bacillus?anthracis)。研究表明，蘇云金芽胞桿菌產生的晶體蛋白可以對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目等昆蟲綱10個目500多種昆蟲以及原生動物、線形動物門、扁形動物門中某些有害種類也有特異的生物活性(SchnepfH?E，Crickmore?N，Rie?J?V，Lereclus?D，Baum?J，Feitelson?J，Zeigler?D?R，Dean?D?H.1998.Bacillus?thuringiensis?and?its?pesticidal?crystal?proteins.Microbiol?Mol?Biol?Rev，62：775-806)。Aroian的實驗室用實驗充分證明了蘇云金芽胞桿菌對線蟲的特異活性(Wei*J.Z.，Hale*K.，Carta?L.，Platzer?E.，WongC.，Fang?S.C.，and?Aroian?R.V.(2003).Bacillus?thuringiensis?Crystal?proteins?that?target?nematodes.Proc.Natl.Acad.Sci.100：2760-2765)。

蘇云金芽胞桿菌野生菌株一般含有多個編碼殺蟲晶體蛋白的基因。自1981年Schnepf和Whiteley從庫斯塔克亞種(subsp.kurstaki)菌株HD-1中克隆得到第一個殺蟲晶體蛋白基因以來，陸續發現并鑒定了許多新的殺蟲晶體蛋白基因。此后，新的殺蟲晶體蛋白基因的克隆一直是蘇云金芽胞桿菌研究領域中的熱點。因此在1995年的無脊椎病理學年會上成立了由Crickmore等學者組成的殺蟲晶體蛋白基因命名委員會，并于1996年正式提出了蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白按氨基酸序列同源性進行分類的新的分類系統，規定了命名規則和分類原則。其規定：cry基因是來自蘇云金芽胞桿菌編碼伴胞晶體蛋白的殺蟲基因或者與已知cry基因有明顯的序列相似性的基因，cyt基因是編碼具有溶細胞活性的伴胞晶體蛋白基因或與已知編碼Cyt蛋白有明顯的序列相似性的基因。根據全長基因推導的氨基酸序列的同源性分為四個等級。級與級之間的界限為同源性95％、78％和45％。截至2008年12月，蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白基因已累計達到55類436種cry基因和2類27個cyt基因(Crickmore?N，Zeigler?DR，Feitelson?J，SchnepfE，van?Rie?J，Lereclus?D，Baum?J，Dean?DH.1998.Revision?ofthe?nomenclature?for?the?Bacillus?thuringiensis?pesticidalcrystal?proteins.Microbiol.Mol.Biol.Rev.62：807-813)。

根結線蟲(Meloidogyne)是一種重要的植物寄生線蟲，主要寄生于被感染植物的塊根、塊莖、鱗莖或球莖上，從寄主體內吸取營養，造成寄主植物的生長發育不良、畸形、矮化甚至死亡，每年都給農業生產帶來重大損失。它們可以寄生于110多種植物，包括大豆、花生、煙草、黃瓜、牡丹等，而茄科、葫蘆科、十字花科等植物的受害尤其嚴重(劉維志，植物病原線蟲學，北京：中國農業出版社，2000)。由于其生活史短，分布面廣，目前已經成為農業生產上最重要的病原生物之一(Widmer?T?L，Abawi?G?S.Mechanism?ofsuppression?of?Meloidogyne?hapla?and?its?damage?by?a?green?manure?of?Sudan?grass.Plant?Disease，2000，85(5)：562-568.)。同時又由于根結線蟲的侵入往往會使真菌和細菌更易侵染植物，是誘發植物病害的重要原因之一(汪來發等.根結線蟲生物防治研究進展.南京林業大學學報(自然科學版)，2002，26(1)：64-68.)。