[發(fā)明專利]重組鼠β-防御素3多肽及其制備方法與用途

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910059595.7
• 申請日: 2009-06-15
• 公開（公告）號: CN101570760A
• 公開（公告）日: 2009-11-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李明遠(yuǎn);江滟;李婉宜;王月玲;鞏天祥;王保寧;楊遠(yuǎn);王歡;蔣忠華
• 申請（專利權(quán)）人: 四川大學(xué)
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/74;C07K14/47;A61K38/17;A61P31/10;C12P21/02;C12R1/19
• 代理公司: 成都科海專利事務(wù)有限責(zé)任公司
• 代理人: 黃幼陵;馬新民

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及重組鼠β-防御素3多肽及其制備方法與用途。

背景技術(shù)

β-防御素廣泛分布于人、鼠、牛、羊、豬的多種器官上皮細(xì)胞內(nèi)，包括皮膚、呼吸道、尿道、腸道和口腔粘膜上皮細(xì)胞等。目前，已經(jīng)運用生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)了大約30種人β-防御素基因和45種鼠β-防御素基因(Michael等，2005)。鼠β-防御素3(MBD-3)的基因上游啟動子有前NF-KB、NF-IL-6和STAT等的結(jié)合位點，當(dāng)病原體相關(guān)模式分子(PAMP)與上皮細(xì)胞表面的模式識別受體(包括CD14，TLRs等)結(jié)合后，在多種促炎因子(TNF-α，IL-1β)參與下，激活NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子，再與啟動子區(qū)的NF-κB、NF-IL-6結(jié)合位點結(jié)合，使其基因激活并轉(zhuǎn)錄和翻譯，屬于誘導(dǎo)性表達(Yang?D，et?al.Cellular?andMolecular?Life?Sciences，2006，in?press)。關(guān)于MBD-3的抗微生物活性，已證實人工合成的MBD-3具有抗金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和白色念珠菌的作用(Burd等，2002)，但未見關(guān)于抗絲狀真菌的相關(guān)報道，而且人工合成的β-防御素，造價昂貴、產(chǎn)量少且不能保證多肽的生物學(xué)活性。

近年來，隨著廣譜抗生素、激素、免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用，以及AIDS的蔓延、器官移植和介入技術(shù)的推廣應(yīng)用，使真菌感染的發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢，美國國家醫(yī)院內(nèi)感染監(jiān)測中心(NN?IS)資料顯示，2004年的真菌感染率為20世紀(jì)90年代的2.4倍(Beck-sagueC，et?al.Infection?Disease，1993，167：1247.)，念珠菌屬和曲霉屬是目前最常見的真菌感染的病原菌(Malcolm?DR.Journal?of?Anitimicrobial?Chemotherapy，2005，56：i5.)，某些真菌引起的系統(tǒng)性感染致死率高達90％。對于艾滋病患者(AIDS)，真菌感染是最常見的機會性感染，其發(fā)病率和死亡率均較高。雖然不同作用機制的抗真菌藥物在治療真菌感染中發(fā)揮了重要作用，但隨著感染菌種逐漸發(fā)生變化，有關(guān)耐藥菌株的報道逐漸增多，使得真菌感染的治療面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供鼠β-防御素3的原核重組質(zhì)粒與該重組質(zhì)粒表達的重組鼠β-防御素3多肽及其制備方法，并證明重組鼠β-防御素3多肽對絲狀真菌具有抑制作用，以便開發(fā)出一類治療絲狀真菌感染的新型藥物，為降低AIDS因機會性感染、醫(yī)院內(nèi)真菌感染的死亡率開辟一條新途徑。

鼠β-防御素3基因(Mbd-3)已在GenBank注冊，注冊號AF092929，其cDNA堿基序列如序列表中SEQ?ID?NO.1所述。本發(fā)明的技術(shù)方案是：運用分子克隆技術(shù)克隆小鼠β-防御素3基因(Mbd-3)，將Mbd-3基因片段插入到原核載體構(gòu)建原核重組質(zhì)粒，然后進行體外表達和表達產(chǎn)物的提取，并用凝血酶酶切釋放出有活性的重組鼠β-防御素3成熟肽，具體步驟依次如下：

1、通過RT-PCR反應(yīng)，獲得鼠β-防御素3成熟肽編碼基因；

2、將上述擴增的鼠β-防御素3基因片段插入到原核載體構(gòu)建原核重組質(zhì)粒，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)菌中進行培養(yǎng)，然后篩選出含有正確插入片段的克隆；

3、利用PCR擴增和限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析重組質(zhì)粒，并進行DNA序列分析；

4、將正確克隆的原核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入工程菌中進行表達，分離純化表達的蛋白即獲得重組鼠β-防御素3融合蛋白(fMBD-3)；

5、采用SDS-PAGE和Western?blot鑒定融合蛋白的正確性；

6、采用凝血酶酶切釋放出成熟有活性的重組鼠β-防御素3成熟肽(rMBD-3)；

7、采用SDS-PAGE、Western?blot和質(zhì)譜分析鑒定重組鼠β-防御素3成熟肽的正確性。

所述原核載體為pET質(zhì)粒系統(tǒng)，所述pET質(zhì)粒系統(tǒng)包括pET28a-c(+)、pET29a-c(+)、pET32a-c(+)等原核表達質(zhì)粒。

對于重組鼠β-防御素3多肽的抗絲狀真菌活性鑒定，采用微量液體稀釋法，實驗證明，重組鼠β-防御素3多肽對絲狀真菌具有明顯的抑制和殺滅作用，其中對曲霉菌的最小抑制濃度(MIC)為5-10μM，最小殺菌濃度(MFC)為25μM；對犬小孢子菌的MIC為0.25μM，MFC為10μM；對紅色毛癬菌的MIC為0.01μM，MFC為0.5μM。

本發(fā)明所涉及的新型小鼠β-防御素多肽3(MBD-3)的制備及其應(yīng)用具有以下有益效果：