[發(fā)明專利]一種新型麥類鉀通道β亞基KTB和KHB基因的核酸序列及其應(yīng)用

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910059463.4
• 申請(qǐng)日: 2009-05-31
• 公開（公告）號(hào): CN101565704A
• 公開（公告）日: 2009-10-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭有良;王峰;王際睿;魏育明;蒲至恩;江千濤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/29
• 分類號(hào): C12N15/29;C07K14/415
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及到一種新型麥類鉀離子通道基因的核酸序列及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

近年來我國(guó)耕地的復(fù)種指數(shù)不斷提高，氮、磷投入日益增多，而由于鉀素資源缺乏，鉀肥總體投入不足，全國(guó)缺鉀土壤的范圍逐漸擴(kuò)大。某些生產(chǎn)區(qū)還存在鉀肥利用效率低的現(xiàn)象，造成了鉀素資源的大量浪費(fèi)。此外，我國(guó)鉀肥資源奇缺，鉀肥主要依賴進(jìn)口，價(jià)格昂貴，不能滿足大規(guī)模種植的需要。因此，提高鉀肥利用效率具有重要的實(shí)踐價(jià)值和理論意義。開發(fā)鉀礦并提高鉀肥生產(chǎn)能力，提高作物對(duì)鉀的利用效率是上述問題的主要手段。

鉀是植物生長(zhǎng)必需的三大營(yíng)養(yǎng)元素之一，在植物中與酶的活化、蛋白質(zhì)合成、光合作用、油脂合成、氣孔運(yùn)動(dòng)、離子平衡及抗逆性都密切相關(guān)。鉀以可溶性無機(jī)鹽形式存在于植物體的細(xì)胞液中，或以離子形態(tài)吸附在原生質(zhì)膠體表面，通過參與植物體的生理、生化過程調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育。小麥高產(chǎn)田施鉀數(shù)量與小麥產(chǎn)量存在極顯著相關(guān)性，同時(shí)，鉀也被認(rèn)為是作物生產(chǎn)的“品質(zhì)元素”，其對(duì)作物品質(zhì)的影響有提高蛋白質(zhì)含量和質(zhì)量的直接方面，以及減少病蟲害、提高抗逆能力的間接影響。

目前小麥鉀離子通道與吸收利用鉀效率的關(guān)系還不清楚。本實(shí)驗(yàn)室從麥類作物中首次克隆到了KAB/KOB的同源基因KTB(來自小麥Triticum)、KHB(來自大麥Hordeum)。通過KTB、KHB與水稻類似基因KOB序列的比較，發(fā)現(xiàn)其具有一定同源性，屬于同一類家族蛋白質(zhì)。本發(fā)明以麥類為材料，利用反向遺傳學(xué)方法，推測(cè)KTB和KHB基因差異及K⁺吸收轉(zhuǎn)運(yùn)通道中與其相關(guān)功能基因的關(guān)系，對(duì)小麥和大麥中該基因表達(dá)以及對(duì)鉀吸收的影響進(jìn)行分析。同時(shí)分析該基因所編碼蛋白在鉀吸收過程中的生物學(xué)功能，利用共表達(dá)技術(shù)探討麥類作物K⁺通道β-亞基與α-亞基在K⁺吸收轉(zhuǎn)運(yùn)功能上的聯(lián)系，為研究如何提高農(nóng)作物自身的鉀營(yíng)養(yǎng)效率提供有利依據(jù)。

本發(fā)明呈現(xiàn)的小麥和大麥電壓門控鉀通道β亞基基因與已報(bào)道的其它物種的電壓門控鉀通道β亞基基因有明顯不同。迄今為止，還沒有相關(guān)的報(bào)道在國(guó)內(nèi)外出版物上發(fā)表過。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供了一種新型小麥和大麥電壓門控鉀通道β亞基KTB和KHB基因序列和氨基酸序列。本發(fā)明以小麥和大麥為材料，利用反向遺傳學(xué)方法，尋找KTB和KHB基因差異及K⁺吸收轉(zhuǎn)運(yùn)通道中與其相關(guān)功能基因的關(guān)系，對(duì)小麥和大麥中該基因表達(dá)以及對(duì)鉀吸收的影響進(jìn)行分析，同時(shí)分析該基因所編碼蛋白在鉀吸收過程中的生物學(xué)功能，利用共表達(dá)技術(shù)探討麥類作物K⁺通道β-亞基與α-亞基在K⁺吸收轉(zhuǎn)運(yùn)功能上的聯(lián)系。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

在對(duì)小麥良麥4號(hào)N、P、K吸收效率的研究中，發(fā)現(xiàn)小麥良麥4號(hào)對(duì)K⁺利用效率比其他小麥品種高，因此推測(cè)該品種可能具有特異的K⁺利用通道。本發(fā)明以普通小麥良麥4號(hào)(Triticum?aectricum)和以色列大麥Shade-soil，Israel-36-01，123cDNA為模板，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中已知鉀通道β亞基編碼基因保守片段設(shè)計(jì)引物，利用PCR和分子克隆技術(shù)分離小麥和大麥電壓門控鉀通道β亞基因，然后將獲得的基因序列與NCBI上的電壓門控鉀通道β亞基基因序列進(jìn)行多重比對(duì)并分析它們?cè)谝患?jí)結(jié)構(gòu)上的異同，結(jié)果表明我們首次克隆到小麥和大麥電壓門控鉀通道β亞基基因，分別命名為KTB和KHB。具體方法為：

1、材料誘導(dǎo)

選取由本實(shí)驗(yàn)室篩選的耐鹽、鹽敏感的大麥和小麥材料各1份進(jìn)行誘導(dǎo)。每份材料取10粒種子放入墊有濾紙的培養(yǎng)皿中，加水置于暗室待發(fā)芽，兩天后轉(zhuǎn)到盛有蛭石的花盆中培養(yǎng)，仍然以水為培養(yǎng)液，光暗14/10小時(shí)，白天溫度為22-25℃，夜間溫度為18-20℃交替培養(yǎng)至3葉1心期，換MS培養(yǎng)液適應(yīng)培養(yǎng)兩天后，用低鉀高鈉MS培養(yǎng)液(LK+MS)繼續(xù)培養(yǎng)，每2天換一次培養(yǎng)液。一周后取根部提取總RNA。

LK+MS大量母液中，以硝酸氨和磷酸二氫氨代替硝酸鉀和磷酸二氫鉀，每升LK+MS培養(yǎng)液中，補(bǔ)加0.0096g硝酸鉀和8.775g氯化鈉使得鉀離子和鈉離子的終濃度分別是100μM和150mM。

MS培養(yǎng)基母液成份表

每升MS培養(yǎng)液中含有下列成份：10*大量元素??100ml