[發明專利]一種新型麥類鉀通道β亞基KTB和KHB基因的核酸序列及其應用

無效

• 申請號: 200910059463.4
• 申請日: 2009-05-31
• 公開（公告）號: CN101565704A
• 公開（公告）日: 2009-10-28
• 發明（設計）人: 鄭有良;王峰;王際睿;魏育明;蒲至恩;江千濤
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C07K14/415
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物基因工程技術領域，特別涉及到一種新型麥類鉀離子通道基因的核酸序列及其應用。

背景技術

近年來我國耕地的復種指數不斷提高，氮、磷投入日益增多，而由于鉀素資源缺乏，鉀肥總體投入不足，全國缺鉀土壤的范圍逐漸擴大。某些生產區還存在鉀肥利用效率低的現象，造成了鉀素資源的大量浪費。此外，我國鉀肥資源奇缺，鉀肥主要依賴進口，價格昂貴，不能滿足大規模種植的需要。因此，提高鉀肥利用效率具有重要的實踐價值和理論意義。開發鉀礦并提高鉀肥生產能力，提高作物對鉀的利用效率是上述問題的主要手段。

鉀是植物生長必需的三大營養元素之一，在植物中與酶的活化、蛋白質合成、光合作用、油脂合成、氣孔運動、離子平衡及抗逆性都密切相關。鉀以可溶性無機鹽形式存在于植物體的細胞液中，或以離子形態吸附在原生質膠體表面，通過參與植物體的生理、生化過程調節植物的生長發育。小麥高產田施鉀數量與小麥產量存在極顯著相關性，同時，鉀也被認為是作物生產的“品質元素”，其對作物品質的影響有提高蛋白質含量和質量的直接方面，以及減少病蟲害、提高抗逆能力的間接影響。

目前小麥鉀離子通道與吸收利用鉀效率的關系還不清楚。本實驗室從麥類作物中首次克隆到了KAB/KOB的同源基因KTB(來自小麥Triticum)、KHB(來自大麥Hordeum)。通過KTB、KHB與水稻類似基因KOB序列的比較，發現其具有一定同源性，屬于同一類家族蛋白質。本發明以麥類為材料，利用反向遺傳學方法，推測KTB和KHB基因差異及K⁺吸收轉運通道中與其相關功能基因的關系，對小麥和大麥中該基因表達以及對鉀吸收的影響進行分析。同時分析該基因所編碼蛋白在鉀吸收過程中的生物學功能，利用共表達技術探討麥類作物K⁺通道β-亞基與α-亞基在K⁺吸收轉運功能上的聯系，為研究如何提高農作物自身的鉀營養效率提供有利依據。

本發明呈現的小麥和大麥電壓門控鉀通道β亞基基因與已報道的其它物種的電壓門控鉀通道β亞基基因有明顯不同。迄今為止，還沒有相關的報道在國內外出版物上發表過。

發明內容

本發明的目的在于提供了一種新型小麥和大麥電壓門控鉀通道β亞基KTB和KHB基因序列和氨基酸序列。本發明以小麥和大麥為材料，利用反向遺傳學方法，尋找KTB和KHB基因差異及K⁺吸收轉運通道中與其相關功能基因的關系，對小麥和大麥中該基因表達以及對鉀吸收的影響進行分析，同時分析該基因所編碼蛋白在鉀吸收過程中的生物學功能，利用共表達技術探討麥類作物K⁺通道β-亞基與α-亞基在K⁺吸收轉運功能上的聯系。

為了實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：

在對小麥良麥4號N、P、K吸收效率的研究中，發現小麥良麥4號對K⁺利用效率比其他小麥品種高，因此推測該品種可能具有特異的K⁺利用通道。本發明以普通小麥良麥4號(Triticum?aectricum)和以色列大麥Shade-soil，Israel-36-01，123cDNA為模板，根據NCBI數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中已知鉀通道β亞基編碼基因保守片段設計引物，利用PCR和分子克隆技術分離小麥和大麥電壓門控鉀通道β亞基因，然后將獲得的基因序列與NCBI上的電壓門控鉀通道β亞基基因序列進行多重比對并分析它們在一級結構上的異同，結果表明我們首次克隆到小麥和大麥電壓門控鉀通道β亞基基因，分別命名為KTB和KHB。具體方法為：

1、材料誘導

選取由本實驗室篩選的耐鹽、鹽敏感的大麥和小麥材料各1份進行誘導。每份材料取10粒種子放入墊有濾紙的培養皿中，加水置于暗室待發芽，兩天后轉到盛有蛭石的花盆中培養，仍然以水為培養液，光暗14/10小時，白天溫度為22-25℃，夜間溫度為18-20℃交替培養至3葉1心期，換MS培養液適應培養兩天后，用低鉀高鈉MS培養液(LK+MS)繼續培養，每2天換一次培養液。一周后取根部提取總RNA。

LK+MS大量母液中，以硝酸氨和磷酸二氫氨代替硝酸鉀和磷酸二氫鉀，每升LK+MS培養液中，補加0.0096g硝酸鉀和8.775g氯化鈉使得鉀離子和鈉離子的終濃度分別是100μM和150mM。

MS培養基母液成份表

每升MS培養液中含有下列成份：10*大量元素??100ml