[發明專利]一種新型的基因突變重組方法及其應用

無效

• 申請號: 200910059019.2
• 申請日: 2009-04-22
• 公開（公告）號: CN101532043A
• 公開（公告）日: 2009-09-16
• 發明（設計）人: 馮紅;萬民遠;楊慶軍;李念;張義正
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: C12P19/34
• 分類號: C12P19/34;C40B50/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種基因的體外分子進化的方法以及該方法在蛋白質(酶)編碼基因的隨機突變文庫構建中的應用。

背景技術

基因突變技術是分子生物學研究中的常用策略，廣泛應用于各種基因功能的改造和研究方面。基因突變技術不僅可以獲得基因中特定序列與基因功能之間關系的信息，而且還可以通過對編碼蛋白質(尤其是各種酶)的基因的突變對相應的蛋白質進行改造，通過這種策略可以研究蛋白質的功能或者對獲得具有新的催化特性的突變蛋白質(酶)。在蛋白質工程領域中，常常需要對某種天然的酶進行改造從而獲得各方面酶學性質得到提高的突變酶。蛋白質工程中的基因突變通常包括定點突變和隨機突變兩種策略，其中，定點突變的針對性強但需要對蛋白質結構與功能的信息有所了解，對于缺乏結構與功能的信息的蛋白質，這種策略往往不能湊效。基因突變另一種策略是蛋白質(酶)的體外定向進化(in?vitro?directed?evolution)，它不需事先了解酶的結構和催化機制，而是通過模擬自然進化機制，人為地對編碼蛋白質的基因進行隨機突變，在獲得大量突變體的基礎上應用高通量的篩選策略定向篩選所需要的突變蛋白質(酶)。酶的定向進化技術極大地拓展了蛋白質工程學的研究領域和應用范圍，不僅可以應用于天然酶的改造以獲得催化性能更優異的突變酶，同時也為研究蛋白質(酶)的結構與功能提供了新的途徑。在過去的十多年中，定向進化技術已被廣泛用于改善蛋白質(酶)的多種性質：如酶的穩定性與催化活性、底物特異性、酶的新功能、新型疫苗和藥物分子的發現、抗體親和力的提高等諸多方面。定向進化技術不僅在實驗室用于科學研究，而且已有定向進化的酶制劑進入市場，顯示了蛋白質定向進化技術在蛋白質工程中的巨大應用前景。

目前已經發展出一些方法與技術用于蛋白質的定向進化，并成功地應用于許多蛋白質(酶)的改造。定向進化的第一步，需要應用一定的方法構建一個隨機突變庫。目前主要的方法包括易錯聚合酶鏈式反應(PCR)，由于其簡便快速而成為其中最常用的方法，但通常只能引入單一核苷酸的突變。為了克服易錯PCR的這個缺陷，DNA改組(DNA?shuffling)技術應運而生，其核心就是利用DNase?I隨機切割一組高度同源的核苷酸序列，使之片段化，再通過PCR延伸，最后組裝成一個完整的編碼序列。在這個過程中就可以把不同DNA分子間的突變或差異重組形成一個新的突變基因。DNA?shuffling已經成為目前定向進化研究的主要技術方法，已經成功地應用于多種蛋白質的改造，并取得了良好的效果。DNA?shuffling技術通常需要兩步過程，一是利用易錯PCR獲得突變序列；再利用DNase?I將這些片段隨機切割成小片段，通過無引物的PCR將小片段進行重新延伸組裝獲得一個突變基因庫，DNAshuffling技術在引入突變多樣性上十分高效，但在DNA?shuffling中DNase?I隨機切割操作過程不容易控制，費時費力，必須設立平行實驗。這也是它的不足所在。在DNA?shuffling的基礎上，又發展出一系列改進技術，如家族改組(family?shuffling)，利用單鏈DNA(ssDNAs)為模板的DNA?shuffling等。除了DNA?shuffling外，近年來發展起來的隨機引物體外重組法(random-priming?in?vitro?recombination，RPR)、交錯延伸(staggered?extension?process)等方法也應用于蛋白質(酶)的改造上，但應用的并不廣泛，文獻報道較少。

發明內容

本發明針對常規DNA?shuffling方法的不足，提供了一種基于內切核酸酶(endo?V)的新型的基因隨機突變的方法并將其應用于脫毛蛋白酶隨機突變文庫的構建。