[發明專利]丹參EST-SSR分子標記的制備方法、特異引物及其應用

無效

• 申請號: 200910058747.1
• 申請日: 2009-03-30
• 公開（公告）號: CN101684481A
• 公開（公告）日: 2010-03-31
• 發明（設計）人: 張勇;鄧科君;熊丙全;彭金華;趙曉楠;任正隆
• 申請（專利權）人: 電子科技大學
• 主分類號: C12P19/34
• 分類號: C12P19/34;C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 成都九鼎天元知識產權代理有限公司
• 代理人: 劉明芳;劉雪蓮

1、丹參EST-SSR分子標記的制備方法，包括下述主要步驟：

(1)、丹參EST序列的獲得及預處理：

從GenBank中下載丹參EST序列；去除載體污染和重復序列，去除5’端或3’端的polyT或polyA，進行EST重疊群分析和聚類、去除冗余EST序列，并去除長度小于100bp的EST序列，拼接后得到非冗余Uni-EST序列；

(2)、丹參EST序列中SSR位點的篩選：

采用SSR位點檢索專用軟件，在上述步驟(1)得到的非冗余Uni-EST序列中檢索SSR位點，檢索的限制條件包括：不同重復基元的SSR其總重復序列長度≥20bp；二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸至少重復次數分別為10次、7次、5次、4次、4次；中間被≤5bp的間隔堿基打斷的不完全重復SSR計為一個SSR位點；檢索得到一系列EST-SSR位點。

(3)、丹參EST-SSR引物的設計與合成：

依據上述步驟(2)得到的EST-SSR位點的側翼區域序列，進行引物設計，引物設計主要參數包括：GC含量40％-60％，Tm值45℃-65℃，引物長度18bp-23bp，預期擴增產物長度120bp-350bp；得到的引物序列經Blastn比對，根據結果重點對引物的3’端堿基及正反向引物間隔進行調整，得到一系列EST-SSR位點擴增特異引物；

引物設計完成后進行合成；

(4)、丹參EST-SSR引物的篩選：

采用上述步驟(3)合成的引物，以丹參或者其它鼠尾草屬近緣物種樣品的基因組DNA進行PCR擴增，對擴增產物進行電泳檢測，根據擴增結果，篩選得到可有效擴增的丹參EST-SSR引物。

2、根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：

所述的步驟(4)中，進行PCR擴增時，采用下述擴增體系：

25μL擴增體系中含有：1×PCR?buffer、MgCl₂?1.5mmol/L、dNTPs?200μmol/L、正反向引物各0.5μmol/L、基因組模板DNA?50ng以及Taq?DNA聚合酶0.5U。

3、根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：

所述的步驟(4)中，進行PCR擴增時，采用的PCR擴增程序為：

①94℃預變性3min；

②94℃變性30s、65℃退火30s，每循環降1℃，72℃延伸60s，10個循環；

③94℃變性30s、55℃退火30s、72℃延伸60s、23個循環；

④72℃延伸7min。