[發明專利]順鉑誘導建立的宮頸癌多藥耐藥細胞株

無效

• 申請號: 200910058264.1
• 申請日: 2009-02-02
• 公開（公告）號: CN101503674A
• 公開（公告）日: 2009-08-12
• 發明（設計）人: 王和;劉珊玲;陳新蓮
• 申請（專利權）人: 四川大學華西第二醫院
• 主分類號: C12N5/08
• 分類號: C12N5/08
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬腫瘤生物學領域，涉及一種人宮頸癌耐藥細胞株。具體涉及以人宮頸癌SiHa為親代細胞，通過逐步增加化療藥物順鉑(cDDP)作用濃度，建立了宮頸癌多藥耐藥細胞株SiHa/cDDP。

背景技術

宮頸癌嚴重危害著女性健康，其發病率居女性惡性腫瘤第二位。全世界每年的宮頸癌新發病例約50萬，而我國每年新發病人數約占世界總發病人數的1/3?；熓侵委煂m頸癌的重要手段，但化療中常見且難以解決的問題是多藥耐藥性的產生，即腫瘤同時對多種結構和作用機制不同的化療藥物產生交叉耐藥的現象，它是化療失敗的主要原因。因此研究腫瘤多藥耐藥機制以及防止或逆轉腫瘤多藥耐藥的發生對于提高化療效果十分重要。近年來，腫瘤耐藥細胞株已成為重要的工具，大量研究利用它來揭示腫瘤細胞的耐藥機制、研究腫瘤細胞的耐藥性逆轉、開發及評價新的抗癌方法等。建立腫瘤耐藥細胞株具有重要應用價值。順鉑是宮頸癌化療的常用藥物，因此有必要建立宮頸癌對順鉑的耐藥細胞株。

腫瘤耐藥細胞株的建立通常有兩種方法，一是逐步增加藥物濃度、持續誘導法，二是大劑量沖擊間斷給藥法。國內外均有研究對這兩種方法進行了比較，認為不同誘導方式可能獲得不同耐藥機理的耐藥細胞株，同時也可能影響腫瘤細胞耐藥程度，持續誘導比沖擊誘導更易產生耐藥性。持續誘導法以腫瘤細胞最終能在特定濃度化療藥物中穩定生長作為誘導成功的判定標準，細胞耐藥性穩定、直觀，因此本發明主要采用該法來誘導耐藥細胞的產生。

腫瘤細胞耐藥程度的判定常用耐藥指數(resistant?index，RI)來表示，RI是耐藥細胞半數抑制濃度(50％?inhibitory?concentration，IC50)與親代細胞半數抑制濃度的比值。Snow等按耐藥指數的高低將耐藥性分為低度(＜5)、中度(5-15)、高度(＞15)。

發明內容

本發明的目的是建立宮頸癌耐藥細胞株SiHa/cDDP，為以下相關研究提供耐藥腫瘤細胞模型：研究耐藥腫瘤細胞形態學及生物學特點、研究腫瘤多藥耐藥機制、分析化療藥物敏感性及篩選化療藥物、開發腫瘤耐藥逆轉藥物、研發更有效的腫瘤治療方法等。目前國內外尚無SiHa細胞對cDDP的耐藥株，我們的發明為宮頸癌的研究提供了一種重要的基礎研究模型。

本發明的耐藥細胞株建立步驟如下：(1)人宮頸癌SiHa細胞株，復蘇后用DMEM培養液(含10％小牛血清、青霉素100U/ml、鏈霉素100ug/ml)于37℃、5％CO₂、95％濕度條件下培養；(2)取對數生長期SiHa細胞，換新鮮培養液，加入cDDP，使其作用濃度為0.1μg/ml，在37℃、5％CO₂、95％濕度條件下繼續培養，適時換液，維持0.1μg/ml藥物濃度直至存活細胞能在此濃度穩定生長、傳代；(3)適當增加cDDP的作用濃度，在37℃、5％CO₂、95％濕度條件下繼續培養，適時換液，維持藥物濃度直至存活細胞能在此濃度穩定生長、傳代；(4)重復步驟(3)直到獲得能在2μg/mlcDDP中穩定生長、傳代及復蘇的SiHa/cDDP細胞株。在誘導過程中，掌握適當的cDDP增加濃度非常重要，理想狀況是既通過增加藥物濃度篩選出少數耐藥細胞又不致于使全部細胞死亡，從而不斷獲得有更高耐藥性的SiHa細胞。經過探索，在我們的發明中采用每階段增加0.4或0.5μg/mlcDDP的方法取得了較好效果，歷時9個月建立了SiHa/cDDP耐藥細胞株。用光學顯微鏡觀察細胞形態、MTT法繪制細胞生長曲線、檢測細胞耐藥指數。我們發現，SiHa/cDDP較SiHa細胞有以下變化：細胞較細長，形態不規則，多核細胞更常見；生長速度明顯減慢；對cDDP明顯耐藥，耐藥指數(RI)為16.131，除對cDDP耐藥外，對依托泊苷、紫杉醇、長春新堿、氨甲喋呤、多柔比星、絲裂霉素C有低度交叉耐藥。

附圖說明

圖1是倒置相差顯微鏡下SiHa活細胞觀察圖；圖2是倒置相差顯微鏡下SiHa/cDDP活細胞觀察圖；圖3是光學顯微鏡下SiHa細胞爬片HE染色觀察圖；圖4是光學顯微鏡下SiHa/cDD細胞爬片HE染色觀察圖；圖5是SiHa及SiHa/cDDP細胞生長曲線。

具體實施方式

實施例1