[發明專利]人MAGEA9基因的shRNA及應用

無效

• 申請號: 200910057787.4
• 申請日: 2009-08-27
• 公開（公告）號: CN101993872A
• 公開（公告）日: 2011-03-30
• 發明（設計）人: 黃健;鄧慶;韓澤廣
• 申請（專利權）人: 上海人類基因組研究中心
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;A61K48/00;A61P35/00;A61P1/16
• 代理公司: 上海浦一知識產權代理有限公司 31211
• 代理人: 高月紅

技術領域

本發明涉及一種人MAGEA9基因，特別是涉及一種人MAGEA9基因的shRNA(shorthairpin?RNA，短發夾狀RNA)及應用。

背景技術

肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，因其惡性度高、病情進展快，病人早期一般沒有什么不適，一旦出現癥狀就診，往往已屬中晚期，故治療難度大、療效差。

CT(Cancer-testis，腫瘤-睪丸)抗原，又稱腫瘤共享抗原，一般在正常組織中不表達，但在人生殖細胞系正常表達，在多種不同類型的腫瘤中也均有表達，包括黑色素瘤，膀胱癌，肺癌，肝癌等，這些具有免疫原性的蛋白正在被積極發展為腫瘤治療疫苗的靶點。目前為止已有多達80多個CT抗原家族被鑒定。CT抗原在腫瘤形成中的作用也正在受到進一步評估，精子發生過程中的部分基因表達程序在腫瘤發生時重新開放，可能有助于惡性腫瘤的表型特征-永生化，侵襲性，免疫逃逸，基因組低甲基化和轉移能力。

CT抗原根據編碼它們基因的染色體定位可分為X染色體連鎖CT抗原(X-CT)和常染色體(non-X?CT)即非X染色體連鎖抗原。在正常睪丸中X染色體連鎖的CT抗原通常在精原細胞中表達，而精原細胞是在睪丸中保持不斷增殖的一類生殖干細胞。由于生殖干細胞、發生于胚胎滋養層的細胞和腫瘤細胞有著許多共有的特征，在已知癌基因和抑癌基因無突變的情況下，原本已沉默的生殖細胞系特異性表達基因在腫瘤干細胞中被激活后可以調節腫瘤的惡性表型。值得強調的是，據估計X染色體上約有10％的基因屬于X染色體連鎖CT基因。因此，選取X染色體連鎖的CT基因為對象研究其在肝癌發生發展中的作用機制。

人MAGEA9基因(Genbank?No.NM_005365.4)是CT抗原家族的成員之一。關于MAGEA9基因與肝癌發生的關系有待進一步研究。

發明內容

本發明要解決的技術問題之一是提供一種人MAGEA9基因的shRNA。

本發明要解決的技術問題之二是提供一種人MAGEA9基因的shRNA在制備抑制肝癌細胞生長的藥物中的應用。

為解決上述技術問題，本發明的一種人MAGEA9基因的shRNA，包括：由編碼SEQID?NO.3所示序列和編碼SEQ?ID?NO.4所示序列構成的MAGEA9-sh107，及編碼SEQ?IDNO.5所示序列和編碼SEQ?ID?NO.6所示序列構成的MAGEA9-sh108。

另外，本發明提供一種人MAGEA9基因的shRNA在制備抑制肝癌細胞生長的藥物中的應用。

本發明的人MAGEA9基因的shRNA能顯著抑制人MAGEA9基因表達，使肝癌細胞的存活率顯著低于對照組的細胞，因此，本發明的shRNA可應用于在制備抑制肝癌細胞生長的藥物中，為治療肝癌新藥的開發提供新的途徑。

附圖說明

下面結合附圖與具體實施方式對本發明作進一步詳細的說明：

圖1是定量PCR鑒定各pSUPER載體的RNA干擾靶基因的效果圖；

圖2是各pSUPER載體與pcDNA3.1共轉染PLC/PRF/5、Focus后，重新接種培養，經新霉素篩選后，去除培養液，1×PBS漂洗兩遍后結晶紫染色后照片。

具體實施方式

以下實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊(New?York：Cold?Spring?Harbor?Laboratory?Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實施例1

一.shRNA設計原則

shRNA設計原則與siRNA設計原則相比有其特殊性。源于shRNA的siRNA相對于外源導入的siRNA在細胞內的有效濃度要低。shRNA末端設計以及雙鏈的熱穩定性是以DNA設計為基礎，而siRNA是以mRNA為基礎。

1)從轉錄本(mRNA)的AUG起始密碼開始，尋找“AA或者NA”二連序列，并記下其3’端的19個堿基序列，作為潛在的干擾靶位點。正義鏈和反義鏈都采用這19個堿基(不包括AA或者NA重復)來設計；

2)避免在起始密碼子或無義區域附近選擇目的序列；

3)靶序列的GC含量應為30％～60％左右；

4)盡量避免針對5’和3’端的非編碼區(untranslated?regions，UTRs)設計靶序列，原因是這些地方有豐富的調控蛋白結合區域，而這些UTR結合蛋白或者翻譯起始復合物可能會影響siRNP核酸內切酶復合物結合mRNA從而影響干擾的效果。